二十五味大汤丸，是藏族地区常用的藏药成方，藏药名汤钦尼埃日布，收录于1995年版的《中华人民共和国卫生部药品标准藏药》[1]，属于藏药处方中的平息方，该方由红花、诃子、毛诃子、余甘子、藏木香、木香、波棱瓜子、渣驯膏、石榴子、榜嘎、角茴香、紫菀花、乌奴龙胆、豆蔻、木瓜、猪血粉、甘青青兰、骨碎补、芫荽、獐牙菜、兔耳草、秦艽花、绿绒蒿、水柏枝、巴夏嘎二十五味药组成[2]，方中主药为红花、诃子、毛诃子，余甘子调和诸药。具有开胃、愈溃疡、止痛、治疗月经过多等功能[3]，现代临床常用于急慢性胃炎、浅表性胃炎、胃溃疡、胃酸、胃痛胃胀等胃肠功能紊乱疾病。现有二十五味大汤丸的研究多停留在临床应用和质量标准层面，而关于其活性物质基础的研究尚未有相关研究。为此，确定二十五味大汤丸的主要化学成分对其进一步的药效物质阐明和作用机制研究非常重要。

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS全称为超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱法，具备离子阱质谱多级碎裂和静电场轨道阱高分辨功能，是一种超高效率和灵敏度的液质联用技术，是鉴定中药成分的有效手段之一[4]。基于此，本实验首次利用该技术对二十五味大汤丸中的化学成分进行快速分析鉴定，为深入开展其功效物质基础的研究奠定了基础。

1、材料

1.1仪器

UltiMate 3000型超高效液相色谱仪、LTQ Orbitrap型质谱仪、Xcalibur 2.1化学工作站、TraceFinder 4.1软件(美国Thermo Fisher公司)，Milli-Q Synthesis型超纯水纯化系统(美国密理博公司)，TGL-16B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，BSA224S型万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2试药

去甲基雏菊叶龙胆酮(批号：23040309)、香叶木素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(批号：21030907)、大波斯菊苷(批号：21053112)、没食子酸(批号：23101303)、柯里拉京(批号：23062603)、绿原酸(批号：22121606)(成都普菲德技术有限公司)；α-亚麻酸(批号：J13IB220095，上海源叶生物科技有限公司)，所有对照品纯度均>98%；二十五味大汤丸(批号：Z54020063，0.5 g/丸，西藏甘露藏药股份有限公司)；质谱级甲醇、甲酸、乙腈(德国Merck KGaA公司)；超纯水为自制。

2、方法

2.1二十五味大汤丸化学成分数据库的建立

通过中药系统药理学数据库与分析平台、中国中医药数据库检索系统，结合相关文献报道，收集二十五味药材的化合物信息(名称、分子式、相对分子量)，构建二十五味大汤丸化学成分数据库。

2.2二十五味大汤丸的制备

应用多功能粉碎机将二十五味大汤丸复方进行粉碎，过60目筛，精确称取0.2 g粉末于10 mL离心管中，加5 mL 50%的甲醇溶液，振荡混匀，超声40 min，于13 000 r·min-1离心10 min，取出，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，测样分析。

2.3对照品溶液的制备

称取对照品去甲基雏菊叶龙胆酮、香叶木素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷适量，粉末置于量瓶中，加50%甲醇使其充分溶解，再稀释至刻度线，摇动混匀，作为混合对照品1；称取对照品大波斯菊苷、没食子酸、柯里拉京、绿原酸适量，粉末置于量瓶中，加50%甲醇使其充分溶解，再稀释至刻度线，摇动混匀，作为混合对照品2；量取对照品α-亚麻酸适量，溶液置于量瓶中，加50%甲醇使其充分溶解，再稀释至刻度线，摇动混匀，作为对照品3。

2.4色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18色 谱 柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(正离子模式：0～1 min，5%B；1～7 min，5%～20%B；7～12 min，20%～24%B；12～15 min，24%～30%B；15～18 min，30%～35%B；18～28 min，35%～60%B；28～34 min，60%～75%B；34～37 min，75%～100%B；37～39 min，100%B；39～39.1 min，100%～5%B；39.1～42 min，5%B。负离子模式：0～1 min，5%B；1～6 min，5%～17%B；6～10 min，17%～23%B；10～20 min，23%～36%B；20～27 min，36%～48%B；27～35 min，48%～76%B；35～38 min，76%～100%B；38～42 min，100%B；42～42.2 min，100%～5%B；42.2～45 min，5%B)，流速0.3 mL·min-1，柱温35℃，进样体积3μL。

2.5质谱条件

数据采集模式为正、负离子模式，应用电喷雾离子源(ESI)；正、负离子模式采集条件相同，均为离子源温度350℃，毛细管温度320℃，毛细管电压35 V，管透镜电压110 V，喷雾电压4 kV，鞘气流速35 L·h-1，辅助气流速10 L·h-1；进行样品全扫描，分辨率30 000，扫描范围m/z50～1250；二级质谱采用DDA动态数据依赖性扫描，选取丰度值排名为前六强的峰进行CID碰撞诱导解离碎片扫描，采用离子阱打拿极检测。

2.6数据采集与预处理

应用Xcalibur 2.1化学工作站采集数据，基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术结合TraceFinder 4.1软件筛查目标化合物。查阅二十五味藏药的化学成分相关文献，收集二十五味藏药的化合物信息(化合物名称、分子式、相对分子量)，汇总成表格，保存为CSV格式，建立数据库。将正、负离子模式下采集的数据导入TraceFinder 4.1软件进行自动筛查匹配，实际分子量与理论分子量的偏差值(δ)设置为5 ppm(1 ppm=1×10-6)，质谱精确性设置为5。最后，进行化合物鉴定，结合相关文献对化合物的精确质量数和质谱裂解碎片及特征碎片离子进行结构推断，确定最终筛选结果。

3、结果

采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS对二十五味大汤丸主要化学成分进行定性分析，总离子流图见图1。筛查目标化合物运用TraceFinder 4.1软件，对两个模式下[M+H]+、[M-H]-检测出来的化合物偏差进行筛选，初步筛选出δ<5 ppm的化合物，获取相关化合物的特征碎片离子图谱，再结合文献和对照品对化合物进行系统分析，最后共鉴定出102个化合物，包括黄酮类30个，有机酸类22个，萜类及三萜类11个，苯丙素类17个，鞣质类10个，其他类12个。

3.1黄酮及其苷类

黄酮类化合物是一种分子结构包含2-苯基色原酮基本母核，由酚羟基苯环和中央碳原子构成的C6-C3-C6结构的化合物。本实验从二十五味大汤丸提取液中鉴定出了30种黄酮及其苷类化合物。黄酮类化合物的母核C环容易发生逆狄尔斯-阿尔德(RAD)裂解，从而生成一系列碎片离子。峰90的保留时间为17.57 min，准分子离子峰m/z259.0240[M-H]-，接连丢失CO产生碎片离子231.0919[M-H-CO]-、203.0218[M-H-2CO]-；丢失CO2产生碎片离子215.1081[M-H-CO2]-、继而丢失一分子CO产生碎片离子186.9501[M-H-CO2-CO]-；丢失一分子CHO产生碎片离子230.1215[M-H-CHO]-；该化合物还发生RAD裂解产生碎片离子151.0763[M-H-C6H4O2]-、107.1646[M-H-C7H4O4]-，通过相关文献[50]和对照品比对，可以确定峰90是去甲基雏菊叶龙胆酮，该化合物属于黄酮化合物中的酮类化合物，分子式为C13H8O6，裂解规律如图2所示。

图1二十五味大汤丸UPLC-LTQ-Orbitrap-MS总离子流图

图2去甲基雏菊叶龙胆酮的裂解规律途径

3.2有机酸及其苷类

二十五味大汤丸中有机酸化合物有22种，包括酚酸类、没食子酸类、单宁类及其苷类等，在负离子模式中，有机酸主要产生[M-H-H2O]-、[M-H-CO]-、[M-H-CO2]-等中性碎片离子峰。峰6的保留时间为1.21 min，准分子离子峰m/z133.0141[M-H]-，同时丢失H2O产生碎片离子114.9936[M-H-H2O]-，再接着丢失一分子CO2产生碎片离子71.0803[M-H-H2O-CO2]-，丢失一分子HCOOH产生碎片离子87.0658[M-H-HCOOH]-，通过相关文献[9]比对，可以确定峰6是苹果酸，分子式为C4H6O5，裂解规律如图3所示。

表1二十五味大汤丸主要成分鉴定结果

图3苹果酸的裂解规律途径

3.3苯丙素类

苯丙素类化合物是一类天然有机化合物，其基本母核包含一个或多个C6-C3单元。这类化合物包括简单苯丙素、香豆素、木脂素等结构类型。本研究从二十五味大汤丸提取液中鉴定出了16种苯丙素类化合物，其结构通常含有多个氧原子、甲氧基、羟基等与芳香环相连接，因此在质谱中可能观察到一系列丢失羟基、羰基、水、甲基或甲氧基的碎片离子峰。峰20的保留时间为3.23 min，准分子离子峰m/z353.0870[M-H]-，丢失H2O产生碎片离子335.1183[M-H-H2O]-、丢失C9H7O3产生碎片离子191.0555[M-H-C9H7O3]-、再丢失H2O产生碎片离子173.0523[M-H-C9H7O3-H2O]-、丢失C7H12O5产生碎片离子179.0301[M-H-C7H12O5]-、再丢失CO2产生碎片离子135.0111[M-H-C7H12O5-CO2]-，通过对照品和相关文献[17]比对，可以确定峰20是绿原酸，分子式为C16H18O9，裂解规律如图4所示。

图4绿原酸的裂解规律途径

3.4萜类及三萜类

萜类是一类母核具有一个或多个异戊二烯结构首尾相连的聚合体及其衍生物的天然有机化合物，本研究从二十五味大汤丸提取液中鉴定出了12种萜类及三萜类化合物。峰95的保留时间为25.36 min，准分子离子峰m/z487.3416[M-H]-，丢失H2O、CO2分别产生碎片离子469.3708[M-H-H2O]-、443.3362[M-H-CO2]-、同时丢失CO2和H2O产生碎片离子425.3876[M-H-CO2-H2O]-、同时丢失CO2和两分子H2O产生碎片离子407.3242[M-H-CO2-2H2O]-，通过相关文献[53]比对，可以确定峰95是阿江榄仁酸，分子式为C30H48O5，裂解规律如图5所示。

3.5鞣质类化合物

图5阿江榄仁酸的裂解规律途径

Fig 5 Fragmentation pathway of arjunolic acid

鞣质类化合物也称为单宁类化合物，是植物多酚化合物，由没食子酸或其聚合物的葡萄糖、其他多元醇酯、黄烷醇及其衍生物组成。从二十五味大汤丸提取液中鉴定出了10种鞣质类化合物，鞣质类化合物结构中含有六羟基二苯甲酰基结构(HHDP)，分子质量为302，负离子模式下会丢失一个氢，产生m/z301的特征碎片。峰34保留时间为4.85 min，准分子离子峰m/z633.0717[M-H]-，丢失一个没食子酸产生碎片离子463.0073[M-H-gallic]-、丢失一分子没食子葡萄糖单元产生特征碎片离子HHDP 300.9724[M-H-galloyglucose]-，通过对照品和相关文献[12]比对，可以确定峰34是柯里拉京，分子式为C27H22O18，裂解规律如图6所示。

图6柯里拉京的裂解规律途径

3.6其他类

在负离子模式下，从二十五味大汤丸中鉴定出9种其他类化合物。峰14保留时间为2.02 min，准分子离子峰m/z164.0716[M-H]-，丢失一分子氨基产生碎片离子147.0235[M-H-NH3]-、丢失一分子羰基产生碎片离子120.0612[M-H-CO2]-、继而丢失一分子氨基产生碎片离子103.1494[M-H-NH3-CO2]-，通过相关文献[5]比对，可以确定峰14是L-苯丙氨酸，分子式为C9H11NO2，裂解规律如图7所示。

图7 L-苯丙氨酸的裂解规律途径

4、讨论

复方的中药物质基础研究一直以来都是中药现代研究的热点和难点，这些药物的有效成分是由多种复杂成分组合而成的，这些成分共同发挥作用。UPLC-LTQ-Orbitrap-MS同时具备离子阱质谱的多级碎裂和Orbitrap的高分辨功能，具有高灵敏度、高分辨率和精确分子测定等优点，能通过一次进样高通量完成对复杂化学成分的鉴定，是分析鉴定中药复杂体系中化学成分最前沿的技术之一。实验通过使用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS现代分析技术快速分析了藏成方二十五味大汤丸的主要化学成分，共鉴定出了102个化合物，涵盖黄酮类、有机酸类、苯丙素类、萜类及三萜类、鞣质类等多种类型的化合物。总结的各类化合物的裂解规律可为二十五味大汤丸后续成分研究以及同类化合物的鉴定提供一定的参考依据。

现代药理研究表明，黄酮类成分大波斯菊苷、紫云英苷具有抗肿瘤活性，大波斯菊苷还具有促进乳腺癌细胞自噬的能力，能抑制乳腺癌的发展[54]。有机酸类化合物没食子酸具有抗氧化作用，能够减轻氧化应激并抑制炎症反应[55]。五环三萜类化合物熊果酸具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种药理活性且毒性小[56]，单萜中的环烯醚萜苷类马钱苷酸具有保肝、抗炎镇痛、抑菌、抗氧化等活性[57]。苯丙素类化合物咖啡酸具有降低血糖、消炎抗菌、抗氧化、抗凋亡等多种药理活性，对急性肺损伤具有保护作用[58]。鉴定出的化合物涵盖了二十五味组方药材的活性成分，归属成分较多的藏药主要是诃子、毛诃子、余甘子、獐牙菜、木瓜等，组方中这些成分所占克重比例也比较多。

二十五味大汤的组方中的二十五味药，红花和诃子为君药，而藏木香、骨碎补、木瓜、余甘子等为辅药。方中各味药配伍，其性味以辛、温、苦、寒为主，能够温中和胃、收敛止血、祛瘀止痛、清热解毒。君药红花性温，能够疏通经络、活血化瘀、缓解疼痛，对因出血后的机体虚弱情况具有改善作用；毛诃子味甘涩、性平，能够收敛养血、调和诸药。藏木香性温，具有健脾和胃的作用，与木瓜、木香、甘青青兰、獐牙菜、紫菀花等几味药合用可有效保护肺、脾、胃等重要脏器功能；余甘子、猪血粉、石榴子、巴夏嘎味酸涩、性温，有止血功效，对胃溃疡出血症状能够有效控制；獐牙菜、榜嘎、绿绒蒿、波棱瓜子、兔耳草、角茴香几味藏药性凉寒，具有清热、解毒的功效，能够降低机体的炎症反应，改善症状；渣驯膏作为一味矿物药，清除胃中邪热，对胃溃疡具有重要治疗作用[59]。二十五味大汤中的各种藏药的合理配伍，有效改善胃溃疡出血症状，治疗胃溃疡，并抑制病情发展，实现对机体的整体性调节。因此，对藏药成分的深入分析有助于了解其药理作用及临床应用。UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术能够系统、准确地对二十五味大汤丸的化学成分进行表征，为进一步开展该方的药代动力学和药效物质基础研究提供了数据支持，为临床应用提供了理论基础。

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基金资助:2021年中药学(藏药)博士点培育科研支撑计划项目(No.BSDPY-21-08); 2024年度博士点中医学(藏医)学科建设及中药(藏药)学科培育项目藏药炮制学(No.BSDJS-XKJS-24-04);

文章来源:严志宏,许金娣,索朗次仁,等.基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS的二十五味大汤丸化学成分分析[J].中南药学,2024,22(12):3139-3148.