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联合应用抗CK及EpCAM抗体检测食管癌外周血循环肿瘤细胞

2020-10-13 334 上传者：管理员

摘要：目的:探讨联合应用抗细胞角蛋白抗体及抗上皮特异性黏附分子免疫磁珠富集循环肿瘤细胞的方法,用于提高食管癌患者外周血循环肿瘤细胞检测率。方法:将不同数量的食管癌细胞系(KYSE-170、KYSE-180、EC0156)分别与健康志愿者外周血混合后,比较单独使用抗体磁珠及联合使用双抗免疫磁珠时肿瘤细胞的检出率;并应用优化的方法对20例食管癌患者外周血中的CTCs进行富集鉴定。结果:联合应用抗CK和EpCAM抗体用于富集外周血中CTCs的方法能够提高肿瘤细胞的检出率,其差异具有统计学意义(P<0.05);应用优化的方法富集食管癌外周血中的CTCs检出率为75%。结论:联合应用抗CK和EpCAM抗体的免疫磁珠检测体系能够用于检测食管癌外周血中的CTCs,对指导患者的个体化治疗有较高的临床意义。

关键词：
上皮特异性黏附分子
免疫磁珠
循环肿瘤细胞
细胞角蛋白
肿瘤细胞
食管鳞状细胞癌
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食管癌是我国常见的恶性肿瘤,其中以食管鳞状细胞癌为主要的组织学类型,是危害人民健康的主要恶性肿瘤[1]。已有研究表明外周血中的循环肿瘤细胞在外周血中随血运移动,与肿瘤的转移、疗效、复发与预后有密切的联系,CTCs可实时监测指导肿瘤的进展、治疗及其预后评估[2]。目前检测外周血CTCs的方法日新月异,但是常用的是基于细胞学水平的免疫捕获富集外周血CTCs的策略,其主要原理是上皮来源的实质肿瘤细胞表达上皮标志,如细胞角蛋白(cytokeratin,CK)和上皮特异性黏附分子。2004年美国食品和药物管理局批准的CellSearch用于转移性乳腺癌CTCs的检测系统就是采用的EpCAM抗体鉴定[3]。通常,anti-EpCAM用来富集CTCs而CK用来鉴定CTCs。文献报道不同的肿瘤细胞表达CK及EpCAM是有差异的[4,5]。为了进一步提高食管癌外周血中CTCs检测的敏感性和特异性,本研究应用了不同的食管癌细胞系加入到健康志愿者外周血中,比较采用单独的CK或者EpCAM抗体及联合抗CK和EpCAM抗体免疫磁珠富集的细胞回收率,探讨更加优化的肿瘤细胞的富集策略,从而提高食管癌患者CTCs富集方法的准确率和特异性。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源

在获得知情同意后,采集健康志愿者及其食管癌患者的外周血7.5mL。收集解放军总医院第六医学中心胸外科2017年9月至2018年9月治疗的食管鳞状细胞癌患者,其中14例男性和6例女性,年龄范围40～61岁,平均年龄54岁。健康志愿者20例男性和5例女性,年龄范围43～59岁,平均年龄51岁。

1.1.2试剂和材料

抗CK、抗EpCAM抗体免疫磁珠,抗-CK8/18/19-FITC荧光标记抗体、抗-EpCAM-FITC和抗-CD45-PE荧光标记抗体购自MiltenyiBiotec公司(Bergisch Gladbach,Germany);16%多聚甲醛购自Electron Microscopy Sciences公司;Triton-100购自Amersco公司;Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自Madison公司;包被多聚赖氨酸的载玻片购自Thermo Fisher Scientific公司;盖玻片购自FisherScientific公司;细胞核染料DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich公司;枸橼酸抗凝血采血管(ACD)购自BD公司;LS柱购自MiltenyiBiotec公司;氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾、磷酸氢二钠、EDTA等化学试剂均为国产化学纯试剂;RPMI1640、胎牛血清等为美国GibcoBRL公司产品;50mL离心管购自Greiner公司。

1.1.3主要仪器

强磁场磁性细胞分离架/器MACSMulti Stand为Miltenyi Biotec产品;Biophoto光学显微镜为Olympus(Tokyo,Japan)产品;HR-MIX型翻转摇匀仪为北京昊诺斯科技有限公司产品;负压吸引器购自瑞士Integra Biosciences公司;冷冻离心机为Beckman公司生产。

1.1.4细胞系

食管鳞状细胞癌细胞株KYSE-170、KYSE-180为日本兵库县医学院ShimadaY教授惠赠,EC0156肿瘤研究所建系[6]。

1.2方法

1.2.1外周血采集

从健康志愿者和食管癌患者肘正中静脉用ACD枸橼酸采血管采集清晨空腹外周血7.5mL,24小时内进行磁珠富集CTCs。

1.2.2食管癌细胞系的检出率测定

食管癌细胞系KYSE-170、KYSE-180和EC0156用1640培养基培养,将培养的细胞经胰酶消化和2%多聚甲醛固定后,经过梯度稀释获得1000个、100个和10个细胞后加入到7.5mL健康志愿者外周血中。利用单独抗体免疫磁珠及联合抗体免疫磁珠富集的方法富集肿瘤细胞,实验重复3次以上。计算采用不同方法对于三株食管癌细胞系的检出率,并进行统计学分析。

1.2.3食管癌患者外周血循环肿瘤细胞的富集

抗体免疫磁珠正性富集食管癌患者外周血中的肿瘤细胞,首先用A缓冲液将血样转移至50mL离心管,450×g离心5分钟,弃上清;加入红细胞裂解液B至50mL,室温匀速孵育8分钟;450×g离心分钟,弃上清;重复裂解步骤,充分裂解残余的红细胞;加入缓冲液A进行清洗,再次450×g离心5分钟,弃上清;加入抗CK抗体或者抗EpCAM免疫磁珠,将细胞与磁珠混匀,并在4℃避光孵育15分钟;加入10mL缓冲液,450×g离心,弃上清;按照每107个细胞加入500μL缓冲液,重悬细胞;细胞悬液通过LS分离柱,压力冲洗收集细胞,细胞滴在玻片后,室温放置至细胞干燥;滴加2%多聚甲醛固定40分钟,PBS洗涤3次,进行染色。

1.2.4细胞免疫荧光染色及鉴定

细胞滴片以PBS洗涤5分钟,加入0.1%的TritonX-100-PBS孵育5分钟;PBS洗涤后以2%的BSA-PBS室温封闭30分钟;加入anti-CK-FITC、anti-EpCAM-FITC(1∶100)和anti-CD45-PE(1∶1000)荧光抗体室温孵育1小时;0.2%BSA-PBS后,细胞滴片在暗处晾干,加入DAPI封片显微镜下计数。根据细胞表面的荧光标记并且结合细胞形态学分析,确定CTCs标准,细胞的长径大于10μm,抗上皮细胞表面抗原anti-CK+EpCAM+;抗白细胞表面抗原anti-CD45-;细胞核DAPI染色阳性。

1.3统计学处理

实验数据统计分析采用SPSS16.0软件包完成,样本间的比较,采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1应用抗CK抗体及抗EpCAM抗体鉴定不同食管癌细胞系检出情况

用Miltenyi磁珠对混入健康志愿者外周血中的食管癌细胞进行富集,检测回收试验。每组实验重复3次,取平均值。以食管癌KYSE-170细胞为例,用抗CK抗体富集,投入1000个肿瘤细胞,3次富集的平均回收率为66.5%,投入100个细胞其回收率为70.1%,投入10个细胞时的回收率为66.7%;而用抗EpCAM的抗体富集时,投入1000个肿瘤细胞,回收率为57.8%,投入100个细胞其回收率为68%,投入10个细胞时回收率为60%(表1)。利用方差分析可以得到单独用抗CK抗体或者抗EpCAM抗体富集食管癌细胞系,其回收率之间差异不具有统计学意义(P≥0.05),KYSE-170、KYSE-180及其EC0156细胞系之间回收率差异无统计学意义(P≥0.05)。

2.2联合应用抗CK抗体及EpCAM抗体富集不同食管癌细胞系情况

用抗CK和EpCAM抗体联用的方法,同样富集外周血中加入的不同食管癌细胞系细胞1000个、100个、10个不等,三种食管癌细胞系的富集效率明显增高,最高达到了92%(表1),与单独使用抗CK抗体或者抗EpCAM抗体比较,回收率增高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。不同的食管癌细胞系之间的回收率没有差异(P≥0.05)。

2.3抗CK抗体联合EpCAM抗体富集食管癌患者外周血中的CTCs

应用Miltenyi抗CK、EpCAM抗体免疫磁珠富集20例食管癌患者外周血中CTCs,食管癌外周血CTCs检出15例,检测率为75%(15/20),中位数为21,CTCs的检出范围为0～42个,平均每7.5mL外周血检出CTCs7.83个,相对于平均每毫升外周血检出CTCs1.044个。其中男、女性患者检出率分别为78.6%(11/14)和66.7%(4/6)。5例健康志愿者外周血中未检测出CTCs。如图1所示,利用优化的联合抗体免疫磁珠富集得到食管癌外周血中的CTCs,CTCs形态为细胞较大,核质比较大,上皮细胞特征荧光抗体染色(CK/EpCAM)染色阳性,白细胞表面抗原CD45染色阴性,核染色DAPI为阳性。A、B为两组CTCs的形态,CTCs呈现单独或是几个聚集。

表1不同抗体富集肿瘤细胞检出情况

图1食管癌患者外周血CTCs的免疫磁珠富集

3、讨论

肿瘤缺少辅助临床检测手段以及监控疗效和预后的有效方法[7]。临床主要采用影像学监测肿瘤复发,但其灵敏度不够理想;大多数肿瘤缺乏特异性血清标志,目前常用的血清标志分子鳞癌抗原(SCC)和癌胚抗原(CEA)等特异性较差。肿瘤诊断的“金标准”-组织病理学和细胞学诊断,取材受限,并具有创伤性,无法动态监测疾病进展及预后。而CTCs取材方便,能够实时动态地监测其变化,结合影像学和血清其他标志物SCC和CEA监测疾病进展,对指导食管癌患者个体化治疗具有重要意义。

近年随着免疫磁珠技术、微流控等细胞分选技术的快速发展,使得CTCs研究取得很大的进展。2004年用CellSearch系统检查乳腺癌外周血CTCs数目以判断预后,胰腺癌、结直肠癌肿瘤也有相关研究。因此实体肿瘤外周血CTCs作为了解和监测肿瘤生物学变化及其复发转移的“窗口”备受关注[8,9]。

CTCs的富集的方法总体可以分为两种:基于细胞学和基于核酸的方法[10,11,12],但核酸扩增由于受到引物设计不适、假基因和无细胞形态核酸等原因产生假阳性结果;如果肿瘤细胞没有表达所检测的基因,则会造成假阴性的结果。细胞学的方法对于标记物的选择非常重要,目前常用上皮细胞的特异标记筛选鉴定CTCs,用白细胞共同抗原CD45(在所有白细胞上都有表达,但是在上皮来源的细胞上不表达)作为阴性选择标记,有实验证实CK、EpCAM抗体和CD45抗体对肿瘤细胞核粒细胞各自的特异性均大于99%[13]。细胞角蛋白(CK)是表皮细胞中间丝的组成成分,大概包括20种上皮角蛋白。在正常情况下,外周血内不存在上皮细胞,来源于上皮细胞的恶性肿瘤通常有CK基因的高表达[14]。细胞角蛋白在各种不同细胞类型、不同分化程度、不同功能特征的上皮细胞内存在特异性的表达,所以角蛋白作为免疫组织化学标志物已长期广泛应用于肿瘤的诊断中[15,16]。检测CK分子可判断恶性肿瘤细胞的血行扩散,有助于临床治疗预案、预后的评估及对放化疗监测[17]。

上皮特异性黏附分子(EpCAM)属于黏附分子家族,是由肿瘤相关钙信号转导1基因编码的一个单次跨膜蛋白,参与调节细胞间黏附,介导信号转导细胞迁移增殖和分化等功能[18]。EpCAM作为肿瘤诊断和治疗的候选蛋白,几乎表达于所有的腺癌中,包括结直肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤[19]。正常情况下,EpCAM在食管鳞状上皮呈阴性表达,但是在食管原发鳞状细胞癌中,几乎80%的肿瘤患者出现不同程度的表达[20]。

文献报道较多的是采用抗EpCAM抗体进行肿瘤细胞的富集,抗CK的抗体进行鉴定。但是不同的肿瘤细胞表达EpCAM和CK有一定的差异,可能由于细胞表达的差异造成富集过程中一部分肿瘤细胞未能捕获到[21]。为了检测单独使用抗CK或者抗EpCAM抗体或者是联合应用抗体肿瘤细胞回收率的差异,我们通过在健康志愿者外周血中加入肿瘤细胞,利用免疫磁珠的方法进行富集,结果显示联合应用抗体免疫磁珠富集肿瘤细胞,其回收率较单独使用抗体免疫磁珠的方法有了明显的提高;用优化的方法鉴定了20例食管癌患者外周血CTCs,CTCs的检出率为75%,正常志愿者5人,CTCs的检出为0。结果显示联合应用抗CK及EpCAM抗体的免疫磁珠富集循环肿瘤细胞的检测体系能够提高肿瘤细胞的检测率,有望进一步用于食管癌外周血中的检测。

参考文献：

[13]李燕,陶敏,马德亮,等.用膜滤过联合激光扫描细胞仪检测恶性肿瘤患者循环肿瘤细胞[J].苏州大学学报(医学版),2010,30(1):145-147.

熊鸣,马伟,冯友新,刘东东,乔媛媛.联合应用抗CK及EpCAM抗体检测食管癌外周血循环肿瘤细胞[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3666-3669.

基金:国家自然科学基金青年基金(编号:31500756);军队创新培育工程项目(编号:16QNP023).