首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤细胞论文 > 皮肤鳞状细胞癌组织中Beclin 1、LC3表达与临床病理研究

皮肤鳞状细胞癌组织中Beclin 1、LC3表达与临床病理研究

2023-11-15 109 上传者：管理员

摘要：目的探究皮肤鳞状细胞癌(CSCC)组织中苄氯素1(Beclin 1)、微管相关蛋白l轻链3(LC3)表达与其临床病理特征的关系。方法收集CSCC患者的病变组织60份和非癌症患者的正常皮肤组织30份，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测组织中Beclin 1、LC3在mRNA水平的表达；Western Blot检测组织中Beclin 1、LC3在蛋白水平的表达，免疫组化法检测组织中Beclin 1、LC3表达。结果 CSCC组的组织Beclin 1、LC3 mRNA表达量均明显低于正常组(P<0.05)。Beclin 1和LC3在正常组织中呈高表达，正常组的蛋白表达量均显著高于CSCC组(P<0.05)。Beclin 1和LC3在CSCC组织中部分阳性表达，随着分化程度越低、病理分级越高、淋巴结发生转移，Beclin 1和LC3的阳性表达率均明显降低(P<0.05)。结论 Beclin 1和LC3表达与CSCC发生发展有关，其表达率降低意味着自噬活性降低，CSCC恶性程度高。

关键词：
Beclin 1蛋白
临床病理特征
微管相关蛋白l轻链3蛋白
皮肤鳞状细胞癌
肿瘤
加入收藏

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)好发于光暴露部位，一般恶性程度较低，但一旦发生肿瘤转移则预后较差。目前研究已确定紫外线照射过量、免疫抑制和患有遗传性皮肤病的人群发生转移性CSCC的风险明显增加，但有关CSCC具体病因和机制还尚未明确[1,2]。影响CSCC发生、转移和侵袭的因素众多，因此研究其发生机制对预防和治疗CSCC发生、复发和转移的意义重大。自噬是细胞程序性死亡的方式之一，是真核生物维持自身稳态的过程[3]。既往研究表明[4,5],自噬异常在肿瘤发生、转移和侵袭过程中十分常见，有趣的是细胞自噬在部分疾病中发挥促进细胞死亡的作用，而在另外一部分疾病中，自噬却被认为是应激反应的一种。微管相关蛋白l轻链3(Microtubule-associated protein L light chain 3,LC3)是第1个被发现的自噬相关蛋白，参与自噬体形成，是细胞自噬过程的重要因子。苄氯素1(Beclin 1)基因是一种抑癌基因，主要参与自噬泡形成，通过与PI3K形成复合体来调节自噬活性，因此Beclin 1表达水平能够反映自噬的活性[6]。关于自噬相关蛋白Beclin 1和LC3在口腔鳞状细胞癌、喉鳞癌、宫颈鳞状细胞癌等方面的研究已有广泛基础，但涉及CSCC中的细胞自噬的研究并不常见，并且在不同肿瘤类型或不同器官肿瘤甚至同一肿瘤的不同发展阶段，不同报道显示的自噬活性都有差异[7,8]。因此，本研究从mRNA水平、蛋白水平和组织学方面挖掘Beclin 1和LC3表达与CSCC发生和病理特征的关系，旨在探究CSCC发展与细胞自噬的关系，以期为预防CSCC复发和治疗CSCC提供参考。

1、材料与方法

1.1 临床资料

收集2019年6月至2022年6月于本院皮肤科就诊经病理活检确诊为CSCC患者的病变组织60份和我院普通外科非癌症患者的正常皮肤组织30份。CSCC患者纳入CSCC组，非癌症患者纳入正常组。CSCC组纳入标准：①经组织病理学确诊CSCC,②标本所属患者未接受相关治疗；排除标准：①合并自身免疫异常者，②严重肝肾功能障碍者，③精神状况不稳定者，④合并其他类型恶性肿瘤者，⑤不愿配合者。CSCC组男性39例，女性21例；年龄31～65岁，平均(57.25±9.46)岁。正常组男性20例，女性10例；年龄27～62岁，平均(56.07±9.28)岁。2组年龄和性别等一般资料无显著差异(P>0.05),有可比性。

1.2 方法

1.2.1 组织总RNA提取

取约0.1 g组织，加入Trizol裂解液，匀浆器充分匀浆(TB6342型电动匀浆器，北京普利莱基因技术有限公司),RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测组织Beclin1、LC3表达

根据文献设计引物[9],逆转录试剂盒进行逆转录，以cDNA为模板，PCR扩增试剂盒进行PCR扩增，qRT-PCR检测mRNA表达，所有操作严格按照使用说明书执行。LC3上游引物序列：5'-GAGCTCCAAGTGAGCACATTC-3',下游引物序列：5'-ACTGCTGGAATTACAAGTTCCTAT-3';Beclin 1上游引物序列：5'-AGCTGCCGTTATACTGTTCTG-3',下游引物序列：5'-ACTGCCTCCTGTGTCTTCAATCTT-3'。PCR反应条件：总反应体积20 μl, 95 ℃ 5 min, 15 s 95 ℃,30 s 61.5 ℃,共40个循环。以β-actin为内参，(上游引物序列：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游引物序列：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3')。重复实验3次，取平均值，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

1.2.3 Western Blot检测组织Beclin1、LC3蛋白表达

采用放射免疫沉淀分析缓冲液(Radio immunoprecipitation analysis buffer, RIPA)裂解，全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，严格按照操作说明进行。采用BCA法进行蛋白定量，取50 μg蛋白进行PAGE凝胶电泳，将电泳后的蛋白移至PVDF膜，室温封闭液封闭2 h, 采用洗膜缓冲液洗膜，分别用LC3(1∶1000,Abcam)和Beclin 1(1∶1000,Abcam)兔多克隆抗体和β-actin(1∶1000,Abcam)兔多克隆抗体孵育，4 ℃孵育过夜，洗膜加辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase, HRP)标记的兔抗鼠二抗，于室温下孵育2 h。电化学发光显影，用凝胶图像处理系统分析对比条带强弱，β-actin为内参。实验所用LC3兔多克隆抗体、Beclin 1兔多克隆抗体、β-actin兔多克隆抗体和HRP标记的兔抗鼠二抗均购自美国Abcam公司。

1.2.4 免疫组化检测组织Beclin1、LC3表达

皮肤组织标本经石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化后，HE染色，显微镜下观察，阴性对照组的一抗替换成PBS缓冲液。在显微镜下观察着色情况，由2位经验丰富的病理科医师双盲阅片，组织细胞中呈现棕黄褐色染色的为阳性细胞，在100×显微镜下随机选择10个视野统计阳性细胞数，阳性定义为阳性细胞>50%,阴性定义为阳性细胞≤50%。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，满足正态分布且方差齐的计量资料采用平均数±标准差(x¯±s)

表示，若方差齐，采用两样本独立t检验比较CSCC组和正常组的组间差异；若方差不齐，则用两独立样本非参数检验。计数资料用率表示，采用χ2检验。P<0.05提示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 qRT-PCR检测组织Beclin 1、LC3 mRNA表达

CSCC组的组织Beclin 1、LC3 mRNA表达量均明显低于正常组(P<0.05)。见表1。

表1 qRT-PCR检测组织Beclin 1、LC3 mRNA表达(x¯±s)

2.2 Western Blot检测组织Beclin 1、LC3蛋白表达

Beclin 1和LC3在正常组织中呈高表达，正常组的蛋白表达量均显著高于CSCC组(P<0.05)。见表2。

表2 Western Blot检测组织Beclin 1、LC3蛋白表达量(x¯±s)

2.3 免疫组化检测组织Beclin 1、LC3蛋白表达

Beclin 1和LC3在正常组织中呈阳性表达，正常组的阳性表达率均显著高于CSCC组(P<0.05)。见表3。

表3 免疫组化检测组织Beclin 1、LC3表达(例，%)

2.4 CSCC患者临床病理特征与Beclin 1和LC3表达的关系

Beclin 1、LC3在CSCC细胞中部分阳性表达，CSCC分化程度越低、病理分级越高、发生淋巴结转移，Beclin 1、LC3的阳性表达率均明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 CSCC患者临床病理特征与Beclin 1、LC3表达的关系(例，%)

3、讨论

CSCC是源于表皮的恶性肿瘤，其生长代谢与细胞自噬等细胞程序性死亡息息相关[10,11]。溶酶体将机体多余的蛋白质和亚细胞成分降解的高度保守的细胞行为被称为细胞自噬，该过程有助于维持细胞结构和功能稳定，细胞自噬的作用取决于不同的生理病理状态，其既可以清除具有损伤作用的细胞因子，也可以诱导损伤细胞死亡，在一些特殊状态下还会发生降解正常细胞结构的情况[12,13]。

Beclin 1是参与自噬体形成和成熟的因子，LC3蛋白涉及自噬过程的众多关键步骤，作为调节自噬水平的关键因子，Beclin 1和LC3水平能够反映机体的自噬活性，为基因治疗提供依据。本研究结果显示，CSCC组的组织Beclin 1、LC3 mRNA表达量均明显低于正常组，两者均在正常组织中呈高表达，在CSCC细胞中表达率明显降低，提示在CSCC细胞中，自噬活性明显降低，这可能是因为自噬相关基因Beclin 1和LC3失活导致机体无法快速清除损伤的DNA,细胞内遗传物质缺陷累积，进一步引起其他抑癌基因失活、细胞周期正常程序受阻、细胞凋亡无规律等，最终引起组织恶变[14]。Thongrakard等[15]通过研究皮肤癌A341细胞株，发现恶性肿瘤细胞的自噬活性下降；魏珊珊等[16]的研究表明，非黑色素瘤性皮肤肿瘤的发病可能与Beclin 1/LC3信号通路密切相关，自噬活性降低，非黑色素瘤性皮肤肿瘤的恶性程度越高，与本研究结果一致。

癌细胞由正常细胞异变而来，属于正常机体中的异类成分，自噬活性被抑制会导致这类异变细胞无法被机体清除，使得肿瘤细胞不断生长，并进一步发生转移和侵袭。在对宫颈鳞状细胞癌的实验中发现，LC3Ⅱ和Beclin1的阳性率随组织分化程度和病理分期升高而明显降低，提示宫颈鳞状细胞癌恶性程度越高，细胞自噬活性越低[17]。本研究结果显示，Beclin 1和LC3在CSCC细胞中部分阳性表达，随着CSCC恶化程度越高，Beclin 1和LC3的表达率均明显降低，提示Beclin 1和LC3表达水平与CSCC病理特征有关，恶性肿瘤进展时，其表达会明显降低，意味着细胞自噬活性的进一步衰弱。Beclin 1和LC3可能参与抑制肿瘤转移与侵袭等恶性生物学行为，其活性降低可能打破了组织抑癌基因和原癌基因平衡，促进肿瘤向四周侵袭和转移。有人在对口腔鳞状细胞癌、胰腺癌等的研究中发现了类似现象，表明Beclin 1和LC3可能与CSCC分化程度、病理分级和淋巴结转移等临床病理特征有关[7,18]。

综上所述，自噬相关基因Beclin 1和LC3与CSCC发生和临床病理特征有关，其表达降低意味着自噬活性降低，抑制肿瘤细胞恶性增殖等生物学行为的活性降低，可能导致CSCC进展。目前有关自噬在肿瘤形成和发展中的作用还存在争议，其到底发挥抑制肿瘤生长的作用还是促进恶性生物学行为的问题还未得到妥善解决，这种自噬行为的双向调节作用在不同情况下的作用仍需大量研究证实和补充。

参考文献:

[3]朱娅梅,王嘉睿,马世武.自噬与细胞因子协同维持肝脏稳态[J].肝脏,2020,25(12):1250-1251.

[7]马学华,吴慧芳,陈晓红.LC3Ⅱ､Beclin1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及其与相关病理因素的关系[J].兰州大学学报(医学版),2021,47(2):60-64.

[12]刘威,仝帅,王超凡,等.自噬-溶酶体途径调控核仁小核糖核蛋白RRP9的蛋白质降解[J].医学分子生物学杂志,2022,19(1):20-25.

[16]魏姗姗,严卿文,闫璐,等.mTOR､Beclin1和LC3在非黑色素瘤性皮肤肿瘤中的表达[J].中国老年学杂志,2021,41(11):2279-2283.

[18]任丽平,李先佳,金少举,等.槐定碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬抑制胰腺癌细胞增殖[J].现代预防医学,2021,48(6):1084-1088.

文章来源:郭冰心,田卓,翟翊然.皮肤鳞状细胞癌组织中Beclin 1､LC3表达与其临床病理特征的关系[J].实用癌症杂志,2023,38(11):1835-1838.