胃癌是临床常见肿瘤之一，高发于东亚、西欧及拉丁美洲等地区，其病死率仅次于肺癌和肝癌，5年生存率仅为10%～15%[1]。我国胃癌患者人数约占全球胃癌患者总人数的50%，为社会及家庭带来了沉重的负担[2]。近年来研究发现，胃癌是由饮食、环境和遗传因素共同决定的多因素复杂疾病[3]，但具体作用机制尚未完全明确。1996年，有研究在ErbB2受体型蛋白酪氨酸激酶与蛋白相互作用时首次发现了人类ErbB2转录因子1(TOB1）基因，TOB1蛋白是BTG/TOB家族抗增殖蛋白成员之一，其与细胞核内的转录因子结合，调节基因的表达水平[4]。近期研究发现，TOB1基因表达差异与胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力有关[5,6,7]；且TOB1基因遗传多态性与胃癌发病风险存在密切关系[8]。但在陕西汉族人群胃癌的相关研究中还未见类似报道，因此，本文主要研究TOB1基因rs61482741、rs34700818、rs12601477、rs46264个单核苷酸多态性（SNP）位点与陕西汉族人群胃癌的关系，现将结果报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月至2018年10月本院肿瘤外科和肿瘤内科经病理活检确诊的胃癌患者320例为胃癌组。胃癌临床诊断及病理分期依据《WS316-2010胃癌诊断标准》[9]。胃癌组患者TNM分期为：0期8例，Ⅰ期97例，Ⅱ期124例，Ⅲ期68例，Ⅳ期23例。选取本院经胃镜检查及病理活检排除胃癌的门诊患者350例为对照组。纳入标准：同意加入本研究，并签署知情同意书；均为陕西汉族人群，且无血缘关系，无异族通婚史。排除标准：合并心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤及其他全身性疾病。两组性别、年龄、体质量指数（BMI）等一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取

采集胃癌组和对照组静脉全血2mL，乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝，混匀后取200μL全血待测；采用血液基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，DP348离心柱型）提取DNA，操作步骤严格按照说明书进行；加入100μLpH8.0TEDNA缓冲液洗脱DNA，采用NanoDrop2000微量紫外分光光度计测量基因组DNA水平；采用pH8.0TEDNA缓冲液调整DNA终水平至50ng/μL；置于-80℃冰箱保存备用。

表1两组一般资料比较

1.2.2候选SNP位点选择，引物与酶切位点设计

本研究使用https：//www.ncbi.nlm.nih.gov网站筛选TOB1基因SNP位点，以中国汉族人群数据库最小等位基因频率>0.05为筛选标准，结合相关研究[9]，选定17号染色体rs61482741(NM001243877）、rs34700818(NM001243877）、rs12601477(NM001243877）、rs4626(NM001243877）为本次研究候选SNP位点。采用PrimerPremier5软件设计PCR扩增引物；在https：//genome.ucsc.edu网站使用In-SilicoPCR软件验证各SNP位点PCR扩增引物特异性。PCR扩增引物委托上海生工生物科技有限公司合成。在http：//watcut.uwaterloo.ca网站使用SNP-RFLPanalysis软件筛选4个SNP位点限制性片段长度多态性（RFLP）内切酶位点；限制性内切酶Eam1104I(rs61482741，货号：FD0234）、Csp6I(rs34700818，货号：FD0214）、TaiI(rs12601477，货号：FD1144）、Alw26I(rs4626，货号：FD0034）购于ThermoScientificTM公司。见表2。

表2PCR扩增引物与限制性内切酶片段多态性位点实验设计

1.2.3候选SNP位点基因分型

PCR扩增：采用BIO-RADC1000梯度PCR仪，PCR扩增试剂为康为世纪公司2×TaqPlusMasterMix(Dye）试剂盒（货号：CW2849L），反应体系为2×TaqPlusMasterMix(Dye)25μL，正向引物（10μmol/L)2μL，反向引物（10μmol/L)2μL，模板DNA1μL（约50ng/L），用双蒸馏水补足总体积至50μL。扩增程序：预变性94℃2min；变性94℃30s；退火（rs61482741为55℃30s,rs34700818和rs2601477为58℃30s,rs4624为62℃30s）；延伸72℃30s共30个循环，延伸72℃2min,12℃保存。限制性酶切：4个SNP位点分别取扩增产物5μL加入对应的限制性内切酶[Eam1104I(rs61482741）、Csp6I(rs34700818）、TaiI(rs12601477）、Alw26I(rs4626)]0.5μL,10×FastDigestBuffer1μL，纯水8.5μL补足总体积至15μL酶切体系；37℃孵育15min,80℃灭活10min。取酶切后的产物5μL加入康为世纪公司6×Loadingbuffer(CW0610)1μL混合。2.0%琼脂糖凝胶（EB染料）水平电泳，DNAMarker选用DL500DNAMarker试剂盒（Takara公司，货号：3590A），电压110V,30min后使用BIO-RADGelDocXR+凝胶成像仪分析结果。各SNP位点不同RFLP类型片段大小判断标准见表2。为确认分型结果，随机抽取5%标本通过直接测序法验证基因分型结果准确性。

1.3统计学处理

采用SPSS17.0软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数或百分率表示，计数资料组间比较、哈迪-温伯格平衡检验均采用χ2检验；采用二元Logistic回归进行风险关联分析，使用年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史等参数校正两组等位基因与基因型差异；连锁不平衡区域单倍体型分析采用Haploview4.2软件，两相邻SNP位点分析以D′=1表示两位点完全连锁，D′=0表示两位点不存在连锁不平衡，D′>0.8表示高度连锁；r2在0到1之间变化反映连锁不平衡程度，r2越接近1表示两位点连锁程度越高。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1TOB1基因候选SNP位点等位基因频率与胃癌的风险关联结果

胃癌组与对照组TOB1基因4个候选SNP位点（rs61482741、rs34700818、rs12601477、rs4626）基因分型结果均符合哈迪-温伯格平衡（P>0.05），两组具有群体代表性，可用于病例-对照研究。TOB1基因内含子区域rs61482741位点G等位基因频率胃癌组为36.4%，高于对照组的29.9%,G等位基因携带者患胃癌风险是C等位基因的1.42倍（P=0.011,95%CI=1.15～1.78）。外显子区域rs4626位点G等位基因频率胃癌组为50.6%，高于对照组的43.1%,G等位基因携带者患胃癌风险是A等位基因的1.41倍（P=0.006,95%CI=1.16～1.76）。内含子区域rs34700818和rs12601477位点等位基因频率在胃癌组与对照组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3TOB1基因候选SNP位点等位基因频率与胃癌的风险关联结果[n(%)]

2.2TOB1基因候选SNP位点基因型、显性模式和隐性模式频率与胃癌的风险关联结果

内含子区域rs61482741位点基因型（CC与GG）比较中，胃癌组GG基因型频率为13.4%，高于对照组的8.6%,GG基因型携带者患胃癌风险是CC基因型的1.91倍（P=0.016,95%CI=1.18～3.23）；在显性模式（GG+CG与CC）胃癌组与对照组比较中，GG+CG基因型携带者患胃癌风险是CC基因型的1.44倍（P=0.032,95%CI=1.05～1.93）；在隐性模式（GG与CG+CC）胃癌组与对照组比较中，GG基因型携带者患胃癌风险是CG+CC基因型的1.68倍（P=0.043,95%CI=1.03～2.74）。外显子区域rs4626位点基因型（GG与AA）比较中，胃癌组GG基因型频率为25.6%，高于对照组的18.6%,GG基因型携带者患胃癌风险是AA基因型的1.85倍（P=0.006,95%CI=1.20～2.85）；在显性模式（GG+AG与AA）胃癌组与对照组比较中，GG+AG基因型携带者患胃癌风险是AA基因型的1.53倍（P=0.023,95%CI=1.10～2.16）；在隐性模式（GG与AA+AG）胃癌组与对照组比较中，GG基因型携带者患胃癌风险是AA+AG型的1.56倍（P=0.028,95%CI=1.09～2.21）。内含子区域rs34700818和rs12601477位点基因型、显性模式和隐性模式频率在胃癌组与对照组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4TOB1基因候选SNP位点基因型、显性模式和隐性模式频率与胃癌的风险关联结果[n(%)]

2.3TOB1基因候选SNP位点连锁不平衡分析

TOB1基因4个SNP位点等位基因分型数据结合其在17号染色体上的位置信息，使用Haploview4.2软件分析得到4个SNP位点的连锁不平衡关联图，见图1。rs61482741、rs34700818和rs12601477位点位于一个连锁不平衡区域，其中rs34700818与rs12601477位点存在高度连锁关系（D′=0.91,r2=0.76),rs61482741与rs34700818位点存在高度连锁关系（D′=0.81,r2=0.52）。连锁分析发现，rs61482741、rs34700818和rs12601477组成的单倍体GAT型频率胃癌组为22.7%，低于对照组的28.9%,GAT单倍体型携带者患胃癌风险比其他单倍体型低（P=0.010,OR=0.72,95%CI=0.57～0.92）。单倍体CAT型频率胃癌组为12.8%，高于对照组的4.1%,CAT单倍体型携带者患胃癌风险比其他单倍体型高（P<0.001,OR=3.44,95%CI=2.19～5.40）。见表5。

表5rs61482741、rs34700818和rs12601477单倍体频率在两组中的分布情况比较（%）

图1TOB1基因候选SNP位点连锁不平衡关联图

3、讨论

胃癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，其具体致病机制尚不明确，目前越来越多的研究发现遗传因素在胃癌的发生、发展中发挥着重要作用。TOB1基因具有抑制细胞增殖的能力，TOB1蛋白低表达可能与胃癌的发生、发展密切相关。

TOB1基因位于常染色体17q21.3-22上，其编码的TOB1蛋白相对分子质量为45000，由345个氨基酸组成，属于BTG/TOB蛋白家族[10,11]。在脊椎动物中，BTG/TOB蛋白家族包括BTG1、BTG2/PC3/Tis21、BTG3/ANA、BTG4/PC3B、TOB1/TOB和TOB2，其共用一个保守的BTG同源氨基末端。研究发现，BTG区域包含BoxA和BoxB两个区域，其中BoxA具有抗增殖作用，BoxB是靶分子特异性结合区域[12]。TOB1蛋白与人类表皮生长因子受体2(HER-2）基因存在高度相关性，TOB1蛋白抑制癌基因HER-2的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖[12]。KUNDU等[13]的体外细胞培养研究发现，胃癌MKN28和AGS细胞系TOB1基因过表达可以激活Smad4及抑制β-连环蛋白信号通路，从而抑制肿瘤细胞增殖。后续还发现胃癌MKN28和AGS细胞系中TOB1基因过表达能阻滞G1前期，诱导细胞凋亡。另外，SEAN等[14]在乳腺癌MCF-7细胞系中发现TOB1基因过表达能阻滞G1～S期，通过瞬时转染在MCF-7细胞中增强TOB1基因表达时可见细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P27表达上调，同时，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达下调，在转染shRNA-TOB1细胞中结果相反。YU等[15]经免疫组织化学分析了97例胃癌组织标本，发现97%的胃癌患者组织中TOB1基因表达缺失或显著下降，蛋白印迹试验发现3/4的胃癌细胞系中存在TOB1蛋白表达下降，磷酸化TOB1蛋白比例明显升高。

近年来，越来越多的证据表明遗传变异在大多数疾病中起到关键作用，特别是在肿瘤疾病中[16]。作为常见的突变形式，多个基因SNP位点在研究中被证明与胃癌相关[17,18]。WANG等[8]收集了506例胃癌患者和548例健康对照者标本，研究了TOB1基因11个候选SNP位点与东北汉族胃癌患病风险的关联，结果发现，与健康对照者比较，rs12601477、rs4626、rs34700818和rs61482741等位点在胃癌患者中存在显著性差异，并且rs12601477、rs34700818、rs12950561、rs9903822、rs11656976、rs7221352和rs61482741位点在一个连锁不平衡区域，rs4626、rs35220381、rs12649115位点在另一个连锁不平衡区域。本研究在陕西汉族胃癌患者中验证发现，rs12601477、rs34700818、rs61482741位点位于一个连锁不平衡区域，与东北汉族结果一致，但东北汉族胃癌患者rs12601477和rs34700818位点的D′为0.99，高于陕西汉族的0.91；而变化最显著的是rs12601477和rs61482741位点，东北汉族胃癌患者D′为0.96，本研究陕西汉族D′下降到0.64。

本研究在等位基因比较中发现，内含子区域rs61482741位点G等位基因频率胃癌组为36.4%，高于对照组的29.9%,G等位基因携带者患胃癌风险是C等位基因的1.42倍，与WANG等[8]研究结果一致；在显性模式（GG+CG与CC）胃癌组与对照组比较中，GG+CG基因型携带者患胃癌风险是CC基因型的1.44倍。在东北汉族人群中，rs61482741位点GG+CG基因型被证明与T3～T4期胃癌风险增加有关[8]。外显子区域rs4626位点显性模式（GG+AG与AA）胃癌组与对照组比较中，GG+AG基因型携带者患胃癌风险是AA基因型的1.53倍。在东北汉族人群的研究中证实，rs4626位点显性模式GG+AG基因型与58岁以上人群患胃癌的风险增加相关[8]。

4、结论

本研究初步验证了人类TOB1基因SNP位点rs61482741和rs4626可能是陕西汉族人群胃癌的易感基因位点，且涉及的多种遗传模型为后续研究提供了方向，也为胃癌的早期预防提供了生物学标志物。

参考文献：

[9]中华人民共和国卫生部.WS316-2010胃癌诊断标准[S].北京:中国标准出版社,2010.

李晓波,范志刚,李婷,白素琴,张清雯.人类ErbB2转录因子1基因多态性与陕西汉族人群胃癌的关系研究[J].国际检验医学杂志,2020,41(12):1473-1478.