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lncRNAMEG3表达水平及甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系

2020-12-28 254 上传者：管理员

摘要：目的：探讨长链非编码核糖核酸(lncRNA)MEG3表达水平及甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系。方法：回顾性分析2015年1月～2017年12月手术治疗的75例垂体腺瘤的临床资料。另外取10例颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织为对照组。采用qRT-PCR法和甲基化特异性聚合酶链反应检测垂体腺瘤组织lncRNAMEG3表达和甲基化状态。垂体腺瘤病人随访至2020年8月，主要研究终点为术后复发。结果：垂体腺瘤组织lncRNAMEG3相对表达量明显低于正常脑组织(P<0.05)，同时其基因甲基化率明显高于正常脑组织(P<0.05)。随访期间，19例复发，复发率为25.33%。与未复发组相比，复发组lncRNAMEG3相对表达量明显降低(P<0.05)，同时其基因启动子甲基化率明显升高(P<0.05)。多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示，lncRNAMEG3相对表达水平降低、启动子甲基化率增高是垂体腺瘤术后复发的独立影响因素(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，lncRNAMEG3低表达组术后复发时间(中位数为17.0个月)较高表达组(中位数为24.0个月)明显缩短(P<0.001);MEG3基因甲基化组术后复发时间(中位数为17.0个月)较非甲基化组(中位数为60.0个月)明显缩短(P<0.05)。结论：与正常脑组织相比，垂体腺瘤组织lncRNAMEG3呈低表达，其启动子甲基化率较高，与术后复发密切相关。

关键词：
lncRNAMEG3
启动子甲基化
垂体腺瘤
术后复发
核糖核酸
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垂体腺瘤属于颅内良性肿瘤，但也具有恶性肿瘤的某些生物学特征，而且完全切除率低，因此术后复发率较高[1]。复发性垂体腺瘤的发病机制复杂。近年来，研究发现长链非编码核糖核酸（longnoncodingRNA,lncRNA）在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[2]。Zhang等[3]研究发现lncRNAMEG3是垂体腺瘤一个潜在的抑制因子。本文探讨lncRNAMEG3表达水平及甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系。

1、资料与方法

1.1标本来源

选择2015年1月至2017年12月经蝶入路显微手术切除的75例垂体腺瘤组织，其中男27例，女48例；年龄18～67岁，平均（46.27±12.33）岁。功能性垂体腺瘤46例，其中生长激素腺瘤30例，泌乳素腺瘤16例；无功能性垂体腺瘤29例。排除术前3个月有溴隐亭或其他生长激素抑制剂治疗史、合并其他恶性肿瘤、内分泌系统疾病或心、肝、肾功能严重不全病人。另外取10例颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织为对照组，其中男3例，女7例；年龄34～62岁，平均（47.80±9.64）岁。两组年龄、性别无统计学差异（P>0.05）。

1.2qRT-PCR检测lncRNAMEG3

取100mg组织研磨成粉。用Trizol试剂（美国Sigma-Aldrich公司）提取组织总RNA。使用PrimeScriptTMRTReagentKit试剂盒（日本Takara公司）逆转录合成cDNA。GAP-DH作为内参。采用OneStepSYBRPrimeScriptTMPCR试剂盒（日本Takara公司）配制PCR反应体系：50℃2min,95℃10min,40个循环（95℃变性15s,60℃退火和延伸1min）。重复3次，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量。MEG3引物序列（正向5'-AGGGGCACTAGGTAGACAGG-3'，正向5'-CGGGTCTCTACTCAAGGGGA-3'，产物大小285bp）委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.3MSP法检测组织lncRNAMEG3基因甲基化状态

取100mg组织，用QIAampDNAMiniKit试剂盒（德国Qiagen公司）提取DNA。使用EZDNA甲基化试剂盒（美国Zymo-Research公司）进行亚硫酸氢盐处理。PCR条件：94℃5min,94℃30s,64.6℃退火30s,72℃延伸1min,72℃7min。用溴化乙锭染色在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，如果出现甲基化引物扩增条带，则判定为甲基化。每个样品进行3次反应。甲基化引物序列：正向5'-AGAGGGAATAGTTTTGAGATTTTTC-3'，反向5'-AAAATCAACTAACGTACCTCTATACGC-3'（产物大小120bp）。非甲基化引物序列：正向5'-GAGGGAATAGTTTTGAGATTTTTTG-3'，反向5'-AAAATCAACTAACATACCTCTATACACC-3'（产物大小119bp）。

1.4随访

随访截止至2020年8月。主要研究终点为术后复发（按月计），即从手术次日至随访截止时间或确诊复发的时间。根据《中国复发性垂体腺瘤诊治专家共识（2019)》[4]确定术后复发。

1.5统计学处理

采用SPSS19.0软件处理；计量资料以±s表示，进行t检验；计数资料采用χ2检验；绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用log-ran检验；采用多因素Cox比例回归风险模型分析影响术后复发的危险因素；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1垂体腺瘤组织lncRNAMEG3表达和甲基化状态

垂体腺瘤组织lncRNAMEG3相对表达量（0.69±0.23）明显低于正常脑组织（1.00±0.18;P<0.05）。垂体腺瘤组织lncRNAMEG3基因启动子甲基化率（77.33%,58/75）明显高于正常脑组织（20.0%,2/10;P<0.05）。无功能性垂体腺瘤组织lncRNAMEG3相对表达量（0.54±0.18）明显低于生长激素腺瘤（0.79±0.23;P<0.05）和泌乳素腺瘤（0.78±0.16;P<0.05）。

2.2垂体腺瘤组织lncRNAMEG3相对表达量和甲基化状态的关系

甲基化组lncRNAMEG3相对表达量（0.60±0.18）明显低于非甲基化组（0.99±0.09;P<0.05）。

2.3垂体腺瘤术后随访复发情况

随访期间，共有19例复发，复发率为25.33%。术后复发组lncRNAMEG3相对表达量（0.44±0.15）较未复发组（0.77±0.19）明显降低（P<0.05），启动子甲基化率（100.0%,19/19）较未复发组（69.64%,39/56）明显增高（P>0.05）。

2.4垂体腺瘤术后复发的影响因素

多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示，肿瘤未全切除、肿瘤侵袭、lncRNAMEG3表达水平降低、MEG3基因启动子甲基化为垂体腺瘤术后复发的独立危险因素（P<0.05；表1）。

2.5lncRNAMEG3相对表达量和甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系

本文lncRNAMEG3相对表达量中位值为0.68,<0.68为低表达组，≥0.68为高表达组。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，lncRNAMEG3低表达组术后复发时间（中位数为17.0个月）较高表达组（中位数为24.0个月）明显缩短（P<0.001）。MEG3基因甲基化组术后复发时间（中位数为17.0个月）较非甲基化组（中位数为60.0个月）明显缩短（P<0.05）。见图1。

3、讨论

垂体腺瘤是一种常见的颅内良性肿瘤，约占颅内肿瘤的10%[5]。近年来，随着基因芯片、高通量测序、RanPull-down等技术的发展，许多lncRNA被发现参与垂体腺瘤生物学过程。Li等[6]利用RNA-seq技术对从促性腺激素腺瘤病人和正常垂体组织中获得的lncRNAs进行全基因组分析，其中MEG3是在垂体腺瘤组织中表达水平最低的基因之一。Gejman等[7]认为MEG3基因甲基化是无功能垂体腺瘤中MEG3表达缺失的一种表观遗传机制。本文无功能垂体腺瘤组织lncRNAMEG3相对表达量明显低于功能性垂体腺瘤，但是与正常脑组织相比，无论是功能性垂体腺瘤还是无功能垂体腺瘤，lncRNAMEG3表达水平均明显降低。因此，我们推断lncRNAMEG3可能在控制垂体腺瘤激素分泌尤其是在临床无功能性腺瘤发病机制的特异性通路中发挥重要作用。除此以外，我们还证实，垂体腺瘤组织MEG3基因表达缺失可能与基因启动子甲基化有关。这与Gejman等[7]的研究结论一致。此外，我们发现MEG3低表达可能是影响垂体腺瘤术后复发的重要独立因素，说明MEG3可能与肿瘤复发的某些分子通路有关，而这些通路可能是功能性腺瘤和无功能性腺瘤复发的共同机制。Uroda等[8]发现MEG3和p53途径之间存在密切联系，MEG3的表达导致p53蛋白的细胞聚集和p53下游靶基因的选择性激活。

表175例垂体腺瘤术后复发影响因素的Cox比例回归风险模型分析结果

图1Kaplan-Meier曲线分析lncRNAMEG3相对表达量和甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系

参考文献：

[1]李兵,张溢华,黄平,等.垂体腺瘤术后复发的危险因素分析[J].中国临床神经外科杂志,2020,25(7):436-438.

[2]王欣瑜,祁迪,王思原,等.长链非编码RNA参与肿瘤发病机制的研究进展[J].华北理工大学学报(医学版),2020,117(3):73-78.

[4]中国垂体腺瘤协作组,中华医学会神经外科学会.中国复发性垂体腺瘤诊治专家共识(2019)[J].中华医学杂志,2019,99(19):1449-1453.

[5]高巍,赵莉红,王玮,等.基于WHO新分类的垂体腺瘤诊断及临床病理分析[J].首都医科大学学报,2020,41(3):364-371.

罗志华,张严国,黄从刚,王春燕,李乾锋.lncRNAMEG3表达水平及甲基化状态与垂体腺瘤术后复发的关系[J].中国临床神经外科杂志,2020,25(12):825-827+830.