结肠癌是全球第三大恶性肿瘤，影响着全世界数百万人[1]。尽管结肠癌的治疗取得了重大进展，但其发病率仍在迅速增加，且5年生存率很低[2]。因此，为改善结肠癌患者的预后，迫切需要寻找新的结肠癌评估指标和靶向治疗指标。

肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidyl arginine deiminase,PAD)属于蛋白水解酶家族成员，可在钙离子存在的情况下催化蛋白质的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基[3]，该不可逆修饰的过程称为瓜氨酸化或脱亚胺化[4]。蛋白质瓜氨酸化是一种复杂的翻译后修饰(posttransla‐tional modification,PTM)过程，发生在多种组织器官中，参与多种疾病的发生发展[5]。瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histones H3,H3cit）主要由PAD4催化介导，可以诱导机体产生广泛的炎症反应，如在类风湿性关节炎患者的血清中，H3cit的含量及其抗体显著增加，引发炎症因子大量产生，进而加重疾病[6]。作为炎症的标志物之一，H3cit可能在癌症进展中发挥作用。Stehr等[7]发现，H3cit与人类结肠癌肿瘤分级和淋巴结转移率显著相关，同时，在结直肠癌细胞系中，H3cit可诱导癌细胞丝状伪足形成，促进细胞运动与迁移。核苷酸寡聚化结构域(nucleotide oligomerization domain,NOD)样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)属于NOD样受体家族[8]。NLRP3的过表达可能通过募集M1样巨噬细胞促进肿瘤微环境的形成，从而加速癌症发展[9]。但是PAD4介导的H3cit形成对于结肠癌的影响及其分子机制仍不清楚，NLRP3作为炎症介质在其中所发挥的作用有待进一步探究。

本研究收集结肠癌患者血清，检测PAD4和H3cit含量并分析二者的相关性，通过过表达SW480细胞中的PAD4检测H3cit水平及其对结肠癌细胞增殖、侵袭及上皮间质转化的影响，并进一步探讨其机制，以期为结肠癌的治疗提供潜在的治疗靶点。

1、材料与方法

1.1 临床样本

收集2020年8月至2022年4月在我院进行结肠癌手术治疗的30例结肠癌患者的血清，排除糖尿病、原发高血压病、慢性肾炎等患有基础疾病以及同时患有其他肿瘤的患者。同期纳入30例健康受试者的血清作为对照组。所有受试者均签署知情同意书，本研究获得我院伦理委员会批准（K202007-10）并在其监督下实施。

1.2 细胞和主要试剂

SW480细胞购自中科院上海细胞库；RPMI 1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；RNAiso Plus试剂盒购自日本Takara公司；SYBR与逆转录试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Transwell购自美国Corning公司；oe-PAD4、oe-NC以及sh-NC、sh-NLRP3慢病毒质粒购自武汉伯远生物科技有限公司；GAPDH、PAD4、NLRP3、IL-1β、IL-18引物由上海生工生物工程有限公司合成；PAD4、H3cit抗体购自美国Abcam公司；NLRP3、N-cadherin、E-cadherin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；ECL化学发光显影剂、BCA蛋白定量试剂盒、CCK-8试剂盒购自南京建成生物工程研究所；EpiQuik免疫沉淀试剂盒购自美国EpigenTek公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ELISA检测血清PAD4和H3cit水平

根据ELISA检测试剂盒的使用说明进行操作。取已经包被好抗体的检测板，制备梯度稀释好的标准品，依次将样品与标准品加入到样品孔与标准品孔中，于37℃培养箱中孵育30 min，然后加入洗液清洗5次，甩尽孔内液体。加入酶标试剂，于37℃培养箱中孵育30 min，同上洗板5次。分别加入显色液A与显色液B，避光37℃孵育10 min，加入终止液，酶标仪检测450 nm处的光密度（optical density,OD）值。

1.3.2 细胞培养

用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养SW480细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长密度和培养基颜色变化更换新鲜培养基。待细胞生长至融合度为70%～80%时进行传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3.3 过表达/沉默细胞系的构建

以2×104个/孔的密度将SW480细胞接种在6孔板中。待细胞生长密度达到70%时转染病毒，分别设置oe-NC组（转染oe-NC）、oe-PAD4组（转染oe-PAD4）、oe-PAD4+sh-NC组（转染oe-PAD4与sh-NC）、oe-PAD4+sh-NLRP3组（转染oe-PAD4与sh-NLRP3）。用阴性对照病毒测定转染条件和感染复数值(multiplicity of infection,MOI)，根据MOI值计算每孔所需病毒量(病毒体积=MOI×细胞数量/病毒滴度，病毒滴度=2×108 TU/mL)。48 h后更换新鲜培养基，72 h后于倒置显微镜下观察并拍照，收集细胞进行下一步检测。

1.3.4 qRT-PCR检测PAD4、NLRP3、IL-1β、IL-18基因表达水平

根据RNAiso Plus试剂盒说明书提取细胞的总RNA，酶标仪测量总RNA的OD260/OD280值。取比值在1.8～2.1之间纯度较好的总RNA样品，逆转录合成cDNA，保存于-80℃冰箱。通过qRT-PCR实验测定各基因表达水平，以GAPDH为内参基因，反应液根据试剂盒说明书进行配制，扩增条件：95℃3 min,1个循环；95℃12 s,62℃40 s,95℃15 s,40个循环。实验重复3次，反应结束后导出数据保存，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。PAD4正向引物5′-TTCTGCCATGGACTGCGAG-3′，PAD4反向引物5′-GGGTATTCCTTGCCCCTGAC-3′；NLRP3正向引物5′-CTGGCATCTGGGGAAACCT-3′，NLRP3反向引物5′-TCTGTGTCACAAGGCTCACC-3′；IL-1β正向引物5′-CCAAACCTCTTCGAGGCACA-3′，IL-1β反向引物5′-AGCCATCATTTCACTGGCGA-3′；IL-18正向引物5′-TCGCAGATGGCTCTTTGCTT-3′，IL-18反向引物5′-GAGGCCGATTTCCTTGGTCA-3′；GAPDH正向引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，GAPDH反向引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。

1.3.5 Western blot检测PAD4、H3cit、NLRP3、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平

加入预冷的RIPA缓冲液，冰上静置20 min，提取总蛋白，以BCA法测定总蛋白浓度。取各样品等量蛋白与蛋白上样缓冲液混合，置于沸水中煮沸，制备12%SDS-PAGE，在凝胶孔内的上样蛋白经恒压电泳分离（80 mA,90 min）后，电转移至PVDF膜(250 V,45 min)，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h,TBST洗膜，膜上滴加稀释后的一抗：PAD4(1:1 000）、H3cit(1:1 000）、NLRP3(1:1 000）、N-cadherin(1:2 000）、E-cadherin(1:2 000),4℃孵育过夜；次日，TBST洗膜，加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1:5 000），室温孵育1 h。TBST洗膜，加入ECL超敏试剂液显色，凝胶成像系统进行拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3.6 CCK-8检测细胞增殖水平

转染后的细胞接种于96孔板中，每组重复3个孔。细胞悬浮液在细胞培养箱中培养过夜。分别在0、24、48、72 h加入10μL CCK-8试剂，置于CO2培养箱中培养1 h。最后用酶标仪记录450 nm处的OD值，通过OD值分析细胞增殖情况。

1.3.7 Transwell检测细胞侵袭能力

在Transwell小室内铺上一层50μL Matrigel,37℃培养箱内放置1 h。取各组细胞，以1×105个/孔接种于8μm Transwell小孔上室，每孔200μL，小室置于12孔板中，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，培养24 h。取出小室加入4%多聚甲醛固定，随后加入结晶紫染色，20 min后使用PBS清洗2次。随机在显微镜下取10个视野拍照，并计数，每组重复3次进行统计分析。

1.3.8 ChIP-qPCR检测H3cit在NLRP3转录起始位点（transcription start sites,TSS）的富集水平

根据EpiQuik免疫沉淀试剂盒说明书进行实验。1%多聚甲醛固定细胞10 min后，加入细胞裂解液超声裂解5 min，于4℃下以12 000 r/min离心10 min，取20μL作为Input，加入一抗4℃孵育过夜，离心后去上清，加入洗脱缓冲液，室温孵育10 min，离心后收集上清，65℃6 h，纯化DNA，参考1.2.4进行qRT-PCR检测。NLRP3 TSS正向引物5′-CTCTCTGCCTCTGCTCTG ATA-3′，NLRP3 TSS反向引物5′-TCGATCCAGGAGT GTGTCCT-3′；β-globin TSS正向引物5′-GGACAGGT ACGGCTGTCATC-3′，β-globin TSS反向引物5′-TTAT GCCCAGCCCTGGCTC-3′。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差的形式呈现，多组数据组间比较采用单因素方差分析，组内两两数据的比较采用LSD-t检验，血清中PAD4和H3cit的相关性采用皮尔逊相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 结肠癌患者血清中PAD4和H3cit水平

ELISA结果显示，与健康受试者比较，结肠癌患者血清中PAD4和H3cit水平升高（P<0.05），见图1a。皮尔逊相关性分析显示，结肠癌患者血清中PAD4和H3cit呈正相关，见图1b。

2.2 过表达PAD4催化H3cit并激活NLRP3信号通路

qRT-PCR结果显示，与oe-NC组比较，oe-PAD4组和oe-PAD4+sh-NC组PAD4、NLRP3、IL-1β、IL-18基因表达水平升高（P<0.05),oe-PAD4+sh-NLRP3组PAD4基因表达水平升高（P<0.05）；与oe-PAD4+sh-NC组比较，oe-PAD4+sh-NLRP3组NLRP3、IL-1β、IL-18基因表达水平降低（P<0.05），见图2。Western blot结果显示，与oe-NC组比较，oe-PAD4组和oe-PAD4+sh-NC组PAD4、H3cit、NLRP3蛋白表达水平升高（P<0.05),oe-PAD4+sh-NLRP3组PAD4、H3cit蛋白表达水平升高（P<0.05）；与oe-PAD4+sh-NC组比较，oe-PAD4+sh-NLRP3组NLRP3蛋白表达水平降低（P<0.05），见图3。

图1 结肠癌患者和健康受试者血清中PAD4和H3cit水平比较  

图2 qRT-PCR检测各组细胞PAD4、NLRP3、IL-1β和IL-18基因表达水平   

图3 Western blot检测各组细胞NLRP3、PAD4和H3cit蛋白表达水平   

2.3 过表达PAD4通过NLRP3促进结肠癌细胞增殖和侵袭

CCK-8结果显示，与oe-NC组比较，oe-PAD4组和oe-PAD4+sh-NC组培养72 h的细胞增殖水平升高（P<0.05）；与oe-PAD4+sh-NC组比较，oe-PAD4+sh-NLRP3组培养72 h的细胞增殖水平降低（P<0.05），见图4。Transwell结果显示，与oe-NC组比较，oe-PAD4组和oe-PAD4+sh-NC组细胞侵袭水平升高（P<0.05）；与oe-PAD4+sh-NC组比较，oe-PAD4+sh-NLRP3组细胞侵袭水平降低（P<0.05），见图5。

2.4过表达PAD4通过NLRP3促进结肠癌细胞上皮间质转化

Western blot结果显示，与oe-NC组比较，oe-PAD4组和oe-PAD4+sh-NC组N-cadherin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.05）；与oe-PAD4+sh-NC组比较，oe-PAD4+sh-NLRP3组N-cadherin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高（P<0.05），见图6。

图4 CCK-8检测各组细胞增殖水平   

2.5 PAD4介导H3cit促进NLRP3转录

ChIP-qPCR结果显示，oe-NC组、oe-PAD4组、oe-PAD4+sh-NC组、oe-PAD4+sh-NLRP3组细胞中H3cit在NLRP3 TSS的富集显著高于对照基因β-globin TSS。此外，与oe-NC组比较，oe-PAD4组、oe-PAD4+sh-NC组和oe-PAD4+sh-NLRP3组H3cit在NLRP3 TSS富集水平进一步增加（P<0.05），见图7。

图5 Transwell检测各组细胞侵袭水平   

图6 Western blot检测各组细胞N-cadherin和E-cadherin蛋白表达水平   

图7 ChIP-qPCR检测H3cit在各组细胞NLRP3 TSS处富集水平  

3、讨论

结肠癌发病隐匿，早期诊断率较低，尽管目前在治疗方面取得了重大突破，但结肠癌仍然是一个关系着人类生命健康的公共卫生问题[10]。由于结肠癌的免疫抑制微环境作用，免疫疗法的效果甚微，放射治疗和靶向药物治疗仍然是结肠癌患者的主要治疗方法[11]。

PAD4基因位于人类1号染色体上，是由663个氨基酸编码组成的分子量约为74 kDa的蛋白[12]。PAD4单体由两个N末端免疫球蛋白样子域和一个高度保守的C末端催化结构域组成[13]。其中，N末端结构域包括一个核定位序列（nuclear localization sequence,NLS），可以介导PAD4的核转运过程以启动核蛋白（如组蛋白）的瓜氨酸化[14]。组蛋白修饰过程主要包括甲基化、乙酰化和瓜氨酸化，在基因调控方面发挥着重要作用。在这些PTM过程中，瓜氨酸化可导致组蛋白的正电荷减少，与DNA静电结合能力减弱，随后染色质解凝，结构打开，促进转录因子与暴露的DNA结合，从而增加某些基因的转录表达[15]。PAD4介导的H3cit可以与其他修饰的组蛋白一起发挥作用，调节基因转录并诱导抑癌基因沉默，从而促进肿瘤发生[16]。例如在乳腺癌细胞中，PAD4诱导H3cit并释放甲胺，进而调节组蛋白的精氨酸甲基化，导致β-雌二醇诱导基因显著减少，从而增强细胞的侵袭、迁移能力[17]。为了评估PAD4及H3cit在结肠癌患者体内的表达情况，本研究通过ELISA检测二者在血清中的含量并进行相关性分析，结果显示，结肠癌患者血清中PAD4和H3cit水平升高，且二者呈正相关，通过进一步分析发现，过表达PAD4可以促进结肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化，表明PAD4介导的H3cit形成可能参与了结肠癌的发生发展。

炎性小体是多蛋白信号平台，在巨噬细胞中被首次发现，在受到危险病原体和相关分子模式激活后介导先天免疫反应[18]。目前研究最多的炎性小体是NLRP3。在炎性小体激活期间，NLRP3募集衔接分子、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated specklike protein containing a CARD,ASC)和caspase-1,ASC包含激活的caspase-1的募集域。随后，活化的caspase-1裂解pro-IL-1β和pro-IL-18分子，释放促炎细胞因子IL-1β和IL-18[19]。据报道，蛋白质的PTM过程会改变NLRP3炎性小体的寡聚化能力或稳定性。例如PAD4介导的H3cit可以调节NLRP3炎性小体寡聚化以及蛋白成分的瓜氨酸化[20]。同时，PAD4过表达可以上调NLRP3相关蛋白（如ASC）的表达[21]。在本研究中，过表达PAD4可以上调H3cit蛋白表达，并上调NLRP3、IL-1β、IL-18的基因和蛋白表达水平，说明过表达PAD4可催化H3cit并激活NLRP3信号通路。当抑制NLRP3信号通路后，过表达PAD4促进结肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的现象被逆转。以上证据表明，PAD4介导的H3cit形成可能通过激活NLRP3信号通路促进结肠癌的发生发展。为了进一步探究PAD4介导的H3cit促进NLRP3表达的机制，本研究通过ChIP-qPCR实验发现，过表达PAD4可促进H3cit在NLRP3 TSS处的富集，说明PAD4通过介导H3cit的形成从而促进NLRP3转录，进而激活反向信号通路。

综上所述，本研究发现结肠癌患者体内PAD4和H3cit水平升高且呈正相关，PAD4介导的H3cit通过转录调控NLRP3的表达，促进结肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化。PAD4与H3cit有望成为结肠癌的治疗靶点，为进一步寻找结肠癌的免疫疗法提供新的参考思路。

基金资助:海南省卫生健康行业科研项目(21A200052);

文章来源:王永琦,刘丽杰,何冬雷,等.PAD4介导H3cit促结肠癌细胞增殖､侵袭和上皮间质转化的机制研究[J].局解手术学杂志,2024,33(04):281-287.