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麻杏石甘汤对发热模型大鼠的解热作用及H2S/CBS体系的影响

2024-03-01 83 上传者：管理员

摘要：目的：证实麻杏石甘汤对脂多糖(LPS)诱导的发热模型大鼠的解热作用，探究其解热机制及其对大鼠脑组织硫化氢(H2S)/胱硫醚-β-合成酶(CBS)体系的影响。方法：将50只无特定病原体(SPF)SD大鼠随机分为空白组、对照组(蒸馏水)、阿司匹林组(0.125 g/kg阿司匹林肠溶片)、麻杏石甘汤低剂量组(3.125 g/kg麻杏石甘汤)、麻杏石甘汤高剂量组(6.250 g/kg麻杏石甘汤),每组各10只。连续灌胃5 d,末次灌胃1 h后，各给药组予以腹腔注射20μg/kg LPS溶液诱导大鼠出现发热模型，空白组予以等剂量0.9%氯化钠注射液。记录造模后5 h内大鼠肛温的变化情况。末次体温测量后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，经腹主动脉收集血液，通过酶联免疫法(ELISA)检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞干扰素-α(IFN-α)的水平；取大鼠脑组织，运用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定脑组织中胱硫醚-β-合成酶(CBS)、硫化氢(H2S) mRNA的表达。结果：与对照组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组具有良好的解热效果，且麻杏石甘汤低、高剂量组均能抑制发热大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表达，麻杏石甘汤高剂量组能抑制发热大鼠血清IFN-α的表达，差异均有统计学意义(P<0.05)。麻杏石甘汤低、高剂量组CBS、H2S mRNA的含量较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：麻杏石甘汤具有良好的解热作用，其机制可能与减少血清中炎症因子的释放有关；同时麻杏石甘汤能降低发热模型大鼠脑组织中CBS、H2S mRNA的表达，并可能发挥了其对脑组织的保护作用。

关键词：
发热
炎性因子
硫化氢
胱硫醚-β-合成酶
麻杏石甘汤
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发热是儿童最常见的临床症状，发热对于机体抵抗感染呈正向作用[1]。当患儿持续高热，机体耗氧量增加，大脑易产生缺氧，伴随内毒素的刺激，患儿可出现谵妄、昏迷和惊厥等症状，一定程度上损伤患儿脑组织。持续发热可引起神经元细胞死亡，是重症病毒性脑炎并发脑衰竭的独立危险因素[2]。

临床中治疗发热常用退热类药物及抗生素类药物。退热类药物在使用频次上存在局限性，对于婴幼儿的免疫系统、肝肾及胃肠功能可能产生损害。抗生素的不合理使用易造成耐药，且常伴随胃肠道症状等不良反应[3]。中医药治疗发热，以辨证论治为基本原则，用药灵活，在缩短热程、缓解全身症状及改善预后等方面具有独特优势[4]。本文采用腹腔注射脂多糖(LPS)诱导发热大鼠模型，探索麻杏石甘汤的解热作用及对模型大鼠脑组织中硫化氢/胱硫醚-β-合成酶(H2S/CBS)体系的影响，现报告如下。

1、实验材料

1.1 动物

无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠，6周龄，体质量(200±20)g, 由湖南斯莱克景达公司提供，于湖南中医药大学动物实验中心屏障级环境中喂养。动物使用许可证号：SYXK(湘)2019-0009。实验动物伦理已通过湖南中医药大学动物实验中心伦理委员会批准(批准号：LLBH-202206090008)。

1.2 药物

麻杏石甘汤由麻黄6 g、燀苦杏仁6 g、生石膏12 g、甘草6 g组成，购于湖南中医药大学第一附属医院中药房。取上方4剂药材量，先煎麻黄，去上沫，纳诸药，去滓滤出药液，再将药渣行二次煎煮，将2次药液混合，浓缩至生药浓度为0.625 g/ml, 此为高剂量组用药浓度。将高剂量组加入等量蒸馏水后得到低剂量组用药浓度(生药浓度为0.3125 g/ml),药液放于4℃避光保存；LPS粉末(索莱宝生物科技有限公司，货号：L8880-10mg)用0.9%氯化钠注射液配制成浓度为20μg/ml的LPS溶液；阿司匹林肠溶片(云南白药集团股份有限公司，货号：ZKA2002)用0.9% 氯化钠注射液配制成浓度为0.0125 g/ml的阿司匹林肠溶片溶液。

1.3 仪器与试剂

台式冷冻离心机(型号CF1524R,SCILOGEX公司);电子天平(型号DJ-10002,福州华志科学仪器有限公司);肛温计(安徽方达药械有限公司);50 ml离心管(货号43009,Beaver公司 );200 μl透明吸头(货号BS1000200,百赛利德公司);大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞干扰素-α(IFN-α)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号E-EL-R0012、E-EL-R2856、E-EL-R3036,伊莱瑞特公司);RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(货号R401-01,Biotium公司)。

2、实验方法

2.1 动物分组

实验大鼠适应性喂养3 d, 每天固定时间(9∶00和15∶00)行适应性肛温测定，取平均值作为大鼠的静息体温。将体温>38.0℃或体温波动>0.5℃的大鼠剔除[5]。将符合条件的大鼠随机分为5组：空白组、对照组、阿司匹林组及麻杏石甘汤低、高剂量组，每组各10只。

2.2 给药及造模

麻杏石甘汤低、高剂量组分别给予相应浓度中药灌胃，剂量均为10 ml/kg, 阿司匹林组给予阿司匹林肠溶片溶液灌胃，剂量为10 ml/kg, 对照组行相同剂量蒸馏水灌胃。均每日1次，连续灌胃5 d。造模前10 h大鼠禁食不禁水，末次灌胃后1 h, 各给药组大鼠腹腔注射LPS(1 ml/kg),空白组腹腔注射等剂量0.9%氯化钠注射液。

2.3 观察指标

2.3.1 体温

造模后每小时检测1次肛温，连续监测5 h[6]。

2.3.2 炎症因子

末次体温测定后，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取腹主动脉血，1000×g离心10 min取血清，检测血清内IL-1β、TNF-α以及IFN-α含量。

2.3.3 H2S、CBS mRNA

运用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测大鼠脑组织中CBS、H2S的含量。取大鼠脑组织，根据试剂盒说明书提取总RNA并合成互补DNA,进行实时荧光定量分析[7]。引物序列由武汉市皮诺飞生物科技有限公司合成。(见表1)

2.4 统计学方法

数据通过SPSS 26.0软件进行处理，计量资料用均数±标准差表示。满足正态性且方差齐，则采用单因素方差分析，两者任意一项不满足则运用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1 各组大鼠体温变化比较

造模后1 h, 对照组、阿司匹林组及麻杏石甘汤低、高剂量组体温均较空白组上升(P<0.05);各给药组体温于造模后3～4 h达到最高值，造模后1、2、4、5 h, 麻杏石甘汤低、高剂量组体温均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。造模后各体温测量时间点，麻杏石甘汤低剂量组体温均高于阿司匹林组，差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表2)

3.2 各组大鼠血清炎性因子水平比较

与空白组比较，对照组IL-1β、TNF-α、IFN-α水平均升高，差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组比较，阿司匹林组及麻杏石甘汤低、高剂量组IL-1β、TNF-α水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05);阿司匹林组、麻杏石甘汤高剂量组TNF-α、IFN-α水平均低于麻杏石甘汤低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。(见表3)

表1 引物序列信息

表2 各组大鼠体温变化比较

表3 各组大鼠干预后血清炎性因子水平比较

3.3 各组大鼠脑组织中H2S、CBS mRNA含量比较

与空白组比较，对照组H2S、CBS mRNA的表达升高；与对照组比较，阿司匹林组及麻杏石甘汤低、高剂量组H2S、CBS mRNA的表达均降低，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(见图1～2)

图1 各组大鼠脑组织中H2S mRNA含量比较

图2 各组大鼠脑组织中CBS mRNA含量比较

4、讨论

麻杏石甘汤是治疗热性咳喘的临床常用方，现代药理学表明，麻黄中的麻黄碱、伪麻黄碱以及挥发油等具有发汗、解热、影响中枢神经兴奋等作用；石膏中的含水硫酸钙、苦杏仁中的苦杏仁苷及甘草中的三萜类等具有解热、抗炎的作用[8]。吴熙等[9]研究发现，麻杏石甘汤联合物理疗法能有效降低患者炎性指标，缓解肺部感染状况，降低神经损伤，改善患者远期预后。陈纯静等[10]运用甲型流感病毒毒株构建小鼠甲流病毒肺炎模型，证实麻杏石甘汤通过调控相关信号通路，能减轻小鼠大脑皮质病理损伤。基于麻杏石甘汤相关药理功效及目前相关研究，本文对麻杏石甘汤的解热功效进行验证，并探究其通过H2S/CBS体系对脑组织发挥保护作用的机制。

人体的体温调节中枢位于下丘脑，下丘脑的后部促进产热，而前部促进散热，两者协调维持人体体温的稳定。LPS通过刺激机体内单核、巨噬、淋巴等细胞，诱导内源性致热原(EP)如IL-1β、TNF-α、IFN-α等的大量表达，EP经由血脑屏障入脑，通过终板血管器作用于视前区-下丘脑前部的体温调节中枢，引起前列腺素、环磷酸腺苷等的释放，使体温调定点上移，体温升高[11]。本研究通过向大鼠腹腔注射LPS诱导其发热，造模后，各给药组大鼠体温较空白组出现明显升高趋势，且血清中IL-1β、TNF-α、IFN-α的含量明显增高，表明大鼠炎性发热模型复刻成功。研究结果显示，麻杏石甘汤低、高剂量组均具有良好的退热效果，且高剂量组退热疗效与阿司匹林组退热疗效相当。麻杏石甘汤低、高剂量组IL-1β、TNF-α水平均低于对照组；麻杏石甘汤高剂量组TNF-α、IFN-α水平低于麻杏石甘汤低剂量组，提示其解热机制可能与降低血清中炎性因子的含量有关，且其疗效可能与药物浓度呈正相关。

H2S是近年来发现的第3类新型气体信号分子[12],有着广泛的生物学效应。H2S不仅对血管舒张、神经传导、胰岛素分泌、糖代谢等过程产生重要影响，还能对细胞发挥双向调控作用[13]。一方面，H2S可以通过抑制细胞色素C的作用而引起细胞死亡；另一方面，H2S能提高谷胱甘肽的水平，起到抗氧化、抗凋亡、抗衰老、促进细胞修复从而发挥对细胞的保护作用。研究表明，H2S能抑制钙离子通道，使神经元膜超极化，并促进神经元蛋白质磷酸化来抑制相关通路的激活，从而对抗缺血、缺氧性神经损伤[14]。董艳军等[15]发现，给予高浓度H2S供体使得血管性痴呆大鼠全脑缺血再灌注损伤加重，而低浓度H2S供体则有助于改善神经损伤，起到对脑组织的保护作用。人体内源性H2S的生成主要依赖于CBS、胱硫醚γ裂解酶(CSE)和巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MST)。CBS主要在脑组织中高度表达，因此可认为脑组织中的H2S的产生和生理功能依赖于CBS的数量和活性[16]。王秀[17]发现，海马神经元中的CBS可产生催化H2S的生成，对脑组织缺氧/复氧损伤起保护作用。本研究中，除空白组外，其余各组大鼠脑组织中CBS、H2S mRNA含量增高，故发热能升高脑组织H2S/CBS的表达。与对照组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组均能显著降低H2S/CBS水平，推测麻杏石甘汤使脑组织中H2S维持在相对低水平从而发挥对脑组织的正向作用。

综上所述，麻杏石甘汤具有良好的解热作用，能抑制炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-α的表达，并显著降低发热大鼠脑组织中CBS、H2S mRNA的含量，提示麻杏石甘汤可能通过影响H2S/CBS体系发挥对脑组织的保护作用。

参考文献:

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[6]吴迪,王清,张殿文,等.柴芩解热颗粒对发热大鼠解热作用及血清TNF-ɑ､IL-1β､PGE2､AVP表达水平的影响[J].北华大学学报:自然科学版,2023,24(1):53-57.

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[8]荆瑶瑶,邢龄艺,李想,等.麻杏石甘汤现代研究概述[J].天津中医药大学学报,2023,42(2):264-272.

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[10]陈纯静,赵澄,张香港,等.基于JAK1/STAT1信号通路研究流感“肺脑传变”的分子机制及麻杏石甘汤干预作用[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(12):12-21.