妊娠对女性而言是一次复杂、巨大的生理变化与生理应激过程，产后恢复更是一个多层面的过程，涉及多个系统之间的相互作用。从狭义的角度来看，产后恢复是指女性生殖器官恢复到孕前状态，从广义的角度是指身体、心理和社会功能恢复到女性自我可接受的基线水平。然而，目前针对妊娠产后恢复的研究，多以产后并发症、后遗症为重点，以恶露、出血、疾病发生率等结局指标作为主要评价指标，无法阐释和解决产后女性生理机能变化的多层面生物学过程，也与产后女性从身、心整体层面上对功能恢复的需求脱节。随着二胎、三胎政策开放，产后恢复情况不仅影响女性短期身体、心理和情感健康，还会影响母婴健康与关系、再次生育选择，更对女性长远生命健康、生活质量有重要影响。

经穴推拿是以按、点、揉等手法作用于经络、腧穴的一种中医外治法，通过改善血液循环、促进组织修复、调解整体机能，临床证实能够有助于产后女性恢复胃肠动力、促进子宫复旧、调整身心状态，改善生活质量。本研究基于转录组学测序（RNA sequencing,RNA-Seq）技术，从整体层面分析经穴推拿对产后大鼠发挥的生物机制作用，为临床探索有效恢复女性产后生理机能的干预靶点提供科学依据，以协助女性实现生育选择、提高生育率提供有效干预思路。

1、材料与方法

1.1 材料

10周龄、SPF级、健康雌性SD大鼠6只（未经产）；10周龄、SPF级、健康雄性SD大鼠2只；均购于斯贝福（北京）生物技术有限公司[SCXK（京）2019-0010]。于北京中医药大学SPF级动物房[SYXK（京）2020-0033]适应性饲养1周。饲养环境：室温（23±1）℃、相对湿度（45±5)%,12h/12h明暗交替，自由饮水，饲喂普通维持饲料由斯贝福（北京）生物技术有限公司[SCXK（京）2019-0010]提供。所有操作均符合北京中医药大学实验伦理学要求（审批号：BUCM-4-2022032502-1123）。

1.2 动物分组

适应性饲养1周后，采用随机数字表法将6只雌性大鼠分为空白对照组（Control Preg‐nancy Group,CP）、经穴推拿组（Tuina Pregnancy Group,TP），每组3只。两组雌鼠与雄大鼠3:1合笼交配，次日早晨观察有无阴栓，并使用光学显微镜观察阴道涂片。若发现精子或阴栓，记为妊娠第0天，单笼饲养，21天后子代大鼠出生后不进行母乳喂养。

1.3 实验干预

经穴推拿组大鼠产后立刻连续推拿干预7天，每天于固定时间使用“按摩推拿手法模拟仪”（专利号ZL200710187403.1），根据由2020年中国针灸学会发布的团体标准T/CAAM 0002-2020《实验动物常用穴位名称与定位-大鼠》选取大鼠百会穴（顶骨正中）、足三里穴（膝关节后外侧，在腓骨小头下约3mm处）、三阴交穴（后肢内踝尖直上10mm）、肾俞穴（在第2腰椎下两旁，背正中线旁开6mm）、关元穴（脐下约25mm处），以具有光滑接触面的按摩头依次按法、揉法，每法每穴1min、共操作10min(1min/穴/法×5穴×2法）后，沿督脉进行推脊1min，于腹部施摩法1min，每只总计12min。空白对照组大鼠产后不采取任何手段进行干预。

1.4 RNA-Seq转录组学测序

大鼠腹主动脉取血，以1:3加入TRIzol试剂（Invitrogen Inc，美国），吹打匀浆、涡旋混匀，室温孵育5min后进行RNA提取。使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scien‐tific Inc，美国）对提取的RNA进行检测，采用琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性（1%琼脂糖凝胶，电压5V/cm,15min），以Agilent 2100生物分析仪（Agi‐lent Technologies Inc，美国）测定RNA完整性值。检测到的RNA若满足总量≥1ug、浓度≥50ng/μL、下光密度比值1.8～2.2，则对样本进行建库。RNA完整性值>8的样本则基于Hi Seq 2500高通量测序平台（ILLumina Inc，美国）对转录出来的所有m RNA进行测序，并按照ILLumina Truseq TM RNA样品制备试剂盒（ILLumina Inc，美国）指示进行差异表达基因测序。

1.5 GO功能分析

从分子功能、细胞成分和生物学过程三个层面对所得的差异表达基因进行GO功能分析，并得到参与的所有功能条目（term），以显著性差异水平（p-value)<0.05为显著性差异条目。采用Goatools软件分析差异基因校正p值（p-adjust），若p-adjust≤0.05，则对选择的差异基因集进行富集分析，获得基因显著富集的功能。

1.6 KEGG信号通路分析

通过KEGG数据库是获得差异基因参与的信号通路条目（pathway），并以显著性差异水平（p-value)<0.05为显著性差异条目。以GO功能富集分析相同的计算法则对KEGG信号通路条目进行富集分析。

2、结果

2.1 RNA-Seq转录组学测序结果

对数据结果进行PCA分析（图1），图中同组各个样本点的距离越近表明样本间相似性越高，说明样本间的生物学重复越好。PCA分析发现经穴推拿组与空白对照组样本数据可完全区分开，说明经穴推拿对产后大鼠在基因层面的影响有显著差异。差异表达基因火山图中（图2），每个点代表一个特定的基因，横坐标为基因在组间表达差异的倍数变化值，纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值（p-value）。结果显示，与空白对照组相比，经穴推拿组大鼠共有959个显著差异表达基因（p-value<0.001），其中889个表达上调，70个表达下调。

图1 两组样本PCA分析  

图2 两组差异表达基因火山图   

2.2 GO功能分析经穴推拿对产后大鼠生物学功能的影响

GO分类结果显示（图3），经穴推拿影响的生物过程包括细胞过程、生物调节、代谢过程、对刺激的反应、细胞成分组织或生物发生等，细胞成分包括细胞单元部分、细胞器、细胞器成分、细胞膜成分、细胞膜等，实现的分子功能包括结合、催化、转录、调节。对差异基因进行GO富集分析，横轴表示富集因子（Rich factor），即富集到纵轴条目的基因数目的比值，点的颜色对应于不同的p-adjust范围，点的大小表示纵轴条目中的基因个数。结果显示，差异基因富集在发育过程调节、细胞代谢过程的负调节、多细胞生物发育的调控、氮化合物代谢过程的负调控、免疫系统过程、多细胞生物过程的正调控、细胞表面受体信号通路、高分子生物合成过程的正调控等过程（图4）。

图3 两组差异表达基因GO分类统计图   

图4 两组差异表达基因GO富集分析   

GO功能富集弦图结果显示（图5），下调基因按差异倍数排序依次为是ENSRNOG00000063619、ENSRNOG00000065781、生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF-15）、EH结构域蛋白2(EH-domain containing 2,Ehd2）、重组人嗅素蛋白4(olfactomedin 4、Olfm4）、氯化物细胞内通道2(chlo‐ride intracellular channel 2,Clic2），基因上调差异倍数最显著依次是AABR07065782.1、ENSRNOG00000066431、ENSRNOG00000070247、Hes家族BHLH转录因子5(Hes5）、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyteassociated protein 4,Ctla4）、胸腺素原（prothymosin alpha,PTMA）。

图5 两组差异表达基因GO功能富集弦图   

2.3 KEGG通路分析经穴推拿对产后大鼠机制通路的影响

差异表达基因KEGG通路注释分析结果显示（图6），经穴推拿干预产后大鼠涉及最多的通路依次为：信号转导、免疫系统、信号分子和相互作用、运输和分解代谢、内分泌系统、细胞生长和死亡等。KEGG富集弦图排除人类疾病相关显示（图7），差异基因主要富集于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路。其中，基因上调差异倍数最显著的依次是CC趋化因子配体2(C-C motif chemo‐kine ligand 2,CCL2）、ENSRNOG00000055111、Ctla4，基因下调差异倍数最显著的是Ehd2。在KEGG数据库对应描述中，CCL2主要参与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路，ENSRNOG00000055111主要参与细胞周期、p53信号通路、卵母细胞减数分裂、细胞衰老、Fox O信号通路，Ehd2主要参与胞吞作用。

图6 两组差异表达基因KEGG通路注释分析  

图7 经穴推拿组和空白组差异表达基因KEGG富集弦图  

3、讨论

转录组学是连接基因组遗传信息与生物功能的必要纽带，转录组学研究已经成为揭示生物生长发育调控和逆境胁迫适应机制、生物进化规律、疾病发生发展的重要机制以及发现致病基因调控关键靶点等方面的最佳研究手段。基于转录组学测序技术进行的前期动物模型研究发现，与非孕产大鼠对比，产后大鼠的差异基因主要集中在与免疫相关的各种生物学过程中，其次为氧化应激、代谢相关的各种生物学过程，符合人类孕产代谢调节、氧化应激和免疫反应调节发生重大变化的特点[1,2]。并且，产后大鼠细胞的生长、凋亡、衰老的互补与平衡过程也明显受到影响，这与临床研究证实的女性细胞衰老进程会随着女性孕产加快[3,4]相吻合。

本研究证实，经穴推拿对产后大鼠在基因层面有显著影响，GO功能分析结果显示差异基因主要集中在代谢、合成、免疫相关生物学过程，KEGG通路分析结果显示差异基因主要参与信号转导、免疫系统、运输和分解通路。在经穴推拿干预后表达水平变化差异倍数显著的基因中，基因AABR07065782.1、ENSRNOG00000066431、ENSRNOG00000070247、GDF-15、Olfm4、Hes5、Ctla4、PTMA、CCL2等参与免疫调节。其中，AABR07065782.1、ENSRNOG00000066431、ENSRNOG00000070247、Ctla4直接参与炎症与免疫反应。GDF-15在病理和应激情况下被诱导，参与调节细胞炎症和凋亡途径与免疫监视和平衡[5]，该基因在经穴推拿后表达显著下调；Olfm4是NF-κB信号通路的靶基因，对多种微生物感染起响应作用，在感染中表达上调[6]，该基因在经穴推拿后表达显著下调；Hes5参与调控造血干细胞向T淋巴细胞分化和发育[7]，该基因在经穴推拿后表达显著上调；Ctla4是一种白细胞分化抗原，诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节，维持机体细胞体液免疫平衡[8,9]，该基因在经穴推拿后表达显著下调；PTMA在细胞外具有免疫调节功能，能够增加IL-2的分泌，介导NK细胞和CD3+T细胞的激活和扩张，恢复并增强受损的淋巴细胞[10,11]，该基因在经穴推拿后表达显著上调；CCL2是一种单核细胞趋化蛋白，是调节单核细胞/巨噬细胞的关键趋化因子之一，可以募集巨噬细胞参与免疫反应[12]，该基因在经穴推拿后表达显著上调。表达水平变化差异倍数显著的基因中，基因ENSRNOG00000063619、ENSRNOG00000065781、Clic2、Hes5等直接调节合成代谢，其中Clic2是胞内氯离子通道蛋白家族的一员[20]，通过调控氯离子与钙离子通道调节细胞的代谢，该基因在经穴推拿后表达显著下调。上述结果提示，经穴推拿促进大鼠产后恢复机制作用与调控免疫反应、参与产后代谢重建过程密切相关。

免疫系统在产后恢复过程中发挥着重要作用：女性在妊娠晚期需要一种可控的无菌炎症状态，才能成功分娩，子宫在生产过程中暴露于细菌中，并在产后至少两周内携带细菌；产后女性免疫机能一旦不能迅速上调，会导致机体不能依赖于免疫系统抵抗感染，可能诱发子宫层发炎导致产后疾病，如子宫炎、肌下炎、子宫内膜炎和乳腺炎等。并且子宫中的这种细菌或微生物负荷还会影响卵巢的周期性，而卵泡发育、卵母细胞释放和黄体形成等卵巢周期性事件是女性获得生育能力和维持生殖能力的关键组成部分，是导致再次妊娠间隔延长、甚至不孕的重要因素。孕产期间，机体受醛固酮、雌激素、孕激素等激素影响，妊娠期间会发生包括体内血容量增加[13]、血脂升高[14]、脂肪率上升等代谢改变，产后则表现为水钠储溜、糖脂代谢异常、体重滞留等。产后由于胃肠动力减弱、失血、疼痛、运动量不足等，使产后代谢缓慢，较难恢复至妊娠前状态，也使产后更容易发生糖脂代谢异常[15]，因此产后代谢的重建对其格外重要。除对身体健康造成影响外，产后代谢水平[16]、免疫系统功能[17]与产后抑郁的发病与康复相关，不仅直接影响女性的身心健康、生活质量，还会间接影响再次妊娠选择。本研究证实，经穴推拿能够从转录组水平改变产后大鼠代谢、免疫相关基因序列。

此外，分析结果还提示，经穴推拿作用于产后大鼠的机制与细胞的生长、分化、衰老与凋亡相关。KEGG通路分析结果中，除直接参与细胞衰老的细胞凋亡、细胞周期、p53信号通路外，PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路同样是参与控制细胞衰老、凋亡进程的关键机制通路[18,19,20,21,22]。表达水平变化差异倍数显著的基因ENSRNOG00000063619、ENSRNOG00000065781、ENSRNOG00000055111、GDF-15、Ehd2、Hes5、Ctla4、PTMA、CCL2等参与细胞生长、分化、衰老与凋亡过程。基因ENSRNOG00000055111在KEGG数据库对应的功能注释描述中主要参与细胞周期、p53信号通路、细胞衰老信号通路；Hes5是具有调控细胞的自身增殖、分化及生长的多目的调控基因，对与细胞分化、组织发育与修复相关的Notch信号通路起正调控作用[23];Ctla4在衰老细胞中会体现出衰老相关的细胞抑制性特征[24];PTMA在细胞核中，可通过抑制细胞色素C释放，在线粒体引发的凋亡途径上起到抑制作用，同时控制细胞周期，促进细胞的增殖[11,25,25];CCL2可通过调节细胞外基质合成参与细胞再生、组织修复和血管生成[12]，以上基因在经穴推拿干预后表达水平均上调。ENSRNOG00000063619以及ENSRNOG00000065781在GO数据库描述中主要参与物质合成、细胞生长过程，对细胞自噬、减数分裂细胞周期进行负调节；GDF-15激活Ras-ERK、PI3K-Akt等细胞衰老相关的信号通路[26];Ehd2通过对膜上蛋白的内吞抑制而增强膜与功能的稳定性、抑制细胞的增殖[27]，以上基因在经穴推拿干预后表达水平均下调。

妊娠过程中，衰老细胞能确保胎儿的正常发育和及时分娩，但衰老细胞对于机体也有不利影响，如促进生殖功能衰老等[4]。一般情况下，衰老死亡的细胞能够被机体的免疫系统清除，同时新生的细胞也不断从相应的组织器官生成，以弥补衰老死亡的细胞。但由于女性产后特殊的免疫状态，会导致大量经历衰老的细胞堆积在组织中，影响组织再生能力的同时，还会影响机体生物学过程，包括胚胎发育、组织修复和再生、肿瘤抑制等[28]。因此，细胞的生长、分化、衰老与凋亡水平对女性产后子宫、卵巢功能恢复有直接影响。细胞衰老的加速不仅不利于女性产后恢复、影响未来再次妊娠选择，还会加速女性生殖衰老，对女性机能产生“促老化”的作用[3,28]。本研究表明，经穴推拿能够从多基因、多靶点、多途径参与调控细胞衰老进程。

综上所述，本研究通过转录组学测序技术，证实经穴推拿可以调控产后大鼠的基因表达水平。通过分析提示，经穴推拿主要通过调控产后机体代谢、免疫、细胞衰老等生物学过程，实现对产后机能恢复的调控作用。本研究在基因层面评估了经穴推拿对产后大鼠的影响，为推拿应用于产后修复提供了研究基础，为经穴推拿促进产后恢复的机制研究提供了新靶点，希望未来有研究进一步挖掘显著差异表达基因及相关功能，完善经穴推拿促进产后恢复的机制。

文章来源:李可,梁笑语,李一凡等.基于RNA-Seq技术分析经穴推拿对产后大鼠的生物学机制作用[J].中医康复,2024,1(04):6-10+17.