膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是骨科诊疗常见的慢性致残性关节疾病，病变涉及软骨、软骨下骨、滑膜及相关肌肉组织，主要病理表现为关节软骨退变、滑膜炎症与继发性骨质增生等[1]。统计学数据显示，我国患KOA患者数十年内增长153.98%,其中45岁以上年龄段人群患病率逐年提升，女性的标准化患病率为男性的1.72倍[2]。KOA患病人数的增加给整个社会带来巨大的医疗困难与经济负担。

坏死性凋亡(Necroptosis)是一种非半胱天冬酶诱导的程序性细胞死亡方式，起源于对病原体的防御，在炎症性疾病中广泛发生，并已被证实在KOA引起的软骨组织损伤中发挥作用[3]。坏死性凋亡的经典表现是细胞器肿胀、胞膜完整性受损、细胞崩解和炎性物质渗出，其发生发展由受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)及混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)的级联激活介导[4]。但在软骨细胞中，有研究指出，与典型的坏死性凋亡程序不同，RIPK1/RIPK3可以通过不依赖MLKL的方式发挥作用，RIPK3的激活足以触发下游事件[5]。因此，抑制RIPK1/RIPK3信号通路以调控软骨细胞坏死性凋亡、改善炎症环境以及维持软骨稳态，在KOA软骨治疗中具有重要作用。

在KOA诊疗方面，西医以非甾体抗炎药作为缓解疼痛的一线药物，而有持续性疼痛、膝关节功能丧失或晚期影像学改变的情况时，膝关节置换等手术干预成为患者的最终选择，本研究认为中医药可以发挥其多靶点、多途径、副作用少的特点，在KOA治疗中发挥优势[6]。桂枝来自于樟科樟属植物肉桂的干燥嫩枝，具有散寒解表、温经通脉、助阳化气等功效，在临床广泛应用[7]。KOA在中医属“痹症”范畴，《素问·痹症》中论其病因，无外乎“风、寒、湿三气”,治宜温经散寒、宣痹通脉[8]。另有研究指出，桂枝的非挥发性提取物具有抑制细胞坏死性凋亡的生理活性，在各种慢性炎症性疾病中具有显著疗效[9]。然而，桂枝对KOA坏死性凋亡软骨细胞的治疗机制尚不完全清楚，本研究旨在探讨桂枝通过调节RIPK1/RIPK3通路对KOA小鼠软骨细胞坏死性凋亡的影响，以期为后续临床用药提供新的思路与参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：

动物实验选取6周龄SPF级C57雄性小鼠，体重20～25 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，以获得南京中医药大学实验动物管理委员会与南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(IACUC-202308A002)。动物分笼饲养在恒温(25±0.5)℃、恒湿(55±5)%的12 h光/暗环境中。

1.1.2主要试剂：

Nec-1(S80716),购自上海源叶生物；RIPK1(17519-1-AP)、p-RIPK1(66854-1-Ig)一抗，购自武汉三鹰生物；RIPK3(ER1901-27)、p-RIPK3(HA721428)一抗，购自杭州华安生物；β-actin(AF7018)一抗，购自Affinity Biosciences。逆转录试剂盒(R222-01)、PCR试剂盒(Q331-02),购自南京诺唯赞；IL-1β(JL18442-48T)、IL-6(JL20268-48T)、TNF-α(JL10484-48T)ELISA试剂盒，购自江莱生物；免疫染色封闭液(P0260)、免疫染色强力通透液(P0097)、抗荧光淬灭封片液(含DAPI)(P0131),购自上海碧云天。

1.1.3主要仪器：

FreeZone型冷冻干燥机，美国Labconco公司；N-1200B EYELA型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；170-3930型蛋白电泳仪及转膜仪系统，美国Bio-Rad公司；NanoDrop One/Onec型微量UV-Vis分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司；MI-3000B型倒置显微镜，德国Leica公司。

1.2方法

1.2.1药物制备：

桂枝购自江苏省中医院中药房。根据实验设计，将50 g桂枝切碎后在6倍量蒸馏水(300 mL)中煮沸、冷却，于3 000 r/min离心10 min,弃去沉淀[10]。滤液用旋转蒸发仪蒸发后，在低温真空干燥箱中冻干至恒质量，置4℃密封保存，用于下一步实验[11]。

1.2.2动物分组：

48只雄性C57小鼠随机分为空白组、造模组、Nec-1组、桂枝低剂量组、桂枝中剂量组、桂枝高剂量组共6组，每组8只。抑制剂组选取坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1),Nec-1组按5 mg/kg剂量，予每日腹腔注射给药[12]。桂枝给药组依据“体表面积比率换算等效剂量法”将人体给药量换算至小鼠，并按照药量的1/3、1/2、2倍，分为低、中、高剂量组，其中桂枝低剂量组按0.43 g/kg剂量、桂枝中剂量组按0.65 g/kg、桂枝高剂量组按2.6 g/kg,予每日灌胃给药[13]。

1.2.3动物造模：

除空白组小鼠外，其余采用内侧半月板失稳手术(DMM)造模，术前禁食8 h,腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，将小鼠膝关节局部备皮消毒后，沿髌骨远端和胫骨平台近端之间的皮肤做一3 mm纵行切口，眼科镊钝性分离内侧半月板前角上的髌下脂肪垫，暴露并剪断内侧胫骨韧带，缝合后使用青霉素腹腔注射3 d以预防感染，分笼饲养[14]。造模结束14 d后，空白组与造模组小鼠每日行等体积生理盐水灌胃，各给药组小鼠予相应药物腹腔注射及灌胃。

1.2.4动物血清及软骨组织提取与保存：

给药28 d后，取各组小鼠，依次使用眼科弯镊夹取并摘除眼球，使血液从眼眶内流入EP管中，待小鼠取血完毕后，断颈处死。取得血浆于室温静置1 h, 3 000 r/min离心10 min,离心完成后取上层淡黄色清液，置于-80℃冰箱保存。处死后的小鼠，切开皮肤，剔除肌肉等组织，取完整膝关节于-80℃冰箱保存。

1.2.5小鼠软骨组织病理形态学观察：

小鼠膝关节组织清理干净后流水冲洗，置于4%多聚甲醛中固定3～5 d,再以10% EDTA溶液脱钙；经相应浓度的梯度纯酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后，切片至5μm厚度；将切片脱蜡至水后，进行苏木精-伊红染色(HE染色)及番红O-固绿染色，染色完成后乙醇脱水，二甲苯透明，树胶固定，光学显微镜下观察。

1.2.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR):

取适量冻存软骨组织，称取重量后按Trizol法提取总RNA并测定吸光度，逆转录反应后进行扩增，按SYBR qPCR mix说明书配置反应体系，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt计算法分析目的基因mRNA表达量。基因引物设计序列见表1。

表1基因引物设计序列

1.2.7蛋白质印迹(WB):

称取提取的软骨组织重量，按说明书要求加入相应比例的RIPA裂解液，液氮条件下研磨后匀浆，按BCA蛋白测定试剂盒说明书操作确定蛋白样品浓度，配平后煮沸蛋白。上样电泳后，运用湿转法转膜至PVDF膜，封闭、洗膜，分别加入一抗RIPK1(1∶1 000)、p-RIPK1(1∶2 000)、RIPK3(1∶1 000)、p-RIPK3(1∶1 000),4℃过夜，洗膜并孵育对应二抗后显影曝光。

1.2.8酶联免疫吸附测定法(ELISA):

取收集的小鼠血清，稀释建立标准曲线并完成加样，37℃恒温孵育30 min,清洗后按照说明书指示加入抗体工作液、底物工作液与终止液，以450 nm测定OD值，并依照标准曲线计算各组样品含量。

1.2.9免疫荧光分析：

将关节组织切片经脱蜡处理后，依次进行柠檬酸钠抗原高温修复，通透液通透、封闭液封闭、RIPK3(1∶200)抗体过夜孵育，清洗后滴加荧光同源二抗孵育，完成后使用倒置生物显微镜观察。

1.3统计学方法

实验数据以x¯±s表示，使用Graph Prism8软件进行统计分析及图文绘制，多组之间采用单因素方差分析(ANOVA),事后多重比较使用LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1组织病理学形态观察

采用HE染色法观察各组小鼠的软骨组织形态，结果示，空白组小鼠软骨关节面光滑平整，滑膜结构完整，软骨细胞排列整齐，无炎性浸润；造模组小鼠软骨组织边缘严重磨损，软骨细胞排列不规则，大量炎性浸润，桂枝低剂量组及中剂量组软骨结构较完整，表面欠光滑；Nec-1组及桂枝高剂量组小鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞分布较均衡，炎性浸润明显减少。见图1。

采用番红O-固绿染色法观察各组小鼠软骨组织形态，结果示，空白组小鼠软骨关节面清晰，软骨细胞排列规整致密，软骨潮线完整；造模组小鼠软骨表面损伤严重，结构混乱，软骨裂隙较深，细胞明显减少、且排列不均，潮线破损；桂枝低剂量组及中剂量组软骨表面较完整，软骨细胞排列趋于整齐；Nec-1组及桂枝高剂量组小鼠软骨细胞再次清晰，排列近似水平，软骨潮线结构恢复。见图1。

图1各组小鼠软骨组织HE染色、番红O-固绿染色(200×)

2.2软骨组织mRNA的表达

研究结果显示，造模组小鼠软骨组织坏死性凋亡特异性指标RIPK1、RIPK3的mRNA表达显著升高(P<0.05),炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平显著升高(P<0.05);使用Nec-1及桂枝后，坏死性凋亡特异性指标RIPK1、RIPK3的mRNA表达显著降低(P<0.05),炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平显著降低(P<0.05)。见图2。

图2各组小鼠软骨RIPK1、RIPK3、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达量

2.3炎症因子水平的变化

小鼠血清ELISA结果显示，造模组较空白组TNF-α、IL-1β、IL-6浓度显著增高(P<0.05);使用抑制剂及桂枝给药后，各炎症因子水平明显降低(P<0.05)。见图3。

2.4软骨组织蛋白的表达

研究结果显示，造模组RIPK1、p-RIPK1、RIPK3、p-RIPK3蛋白表达含量较空白组显著升高(P<0.05),使用Nec-1及各浓度梯度桂枝药物后，RIPK1、p-RIPK1、RIPK3、p-RIPK3蛋白表达含量较造模组显著降低(P<0.05)。见图4。

2.5免疫荧光染色分析

软骨组织RIPK3免疫荧光结果显示，造模组RIPK3荧光强度显著高于空白组(P<0.05);Nec-1组及桂枝给药组荧光强度较造模组显著降低(P<0.05)。见图5。

图3各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较

图4各组小鼠软骨RIPK1、p-RIPK1、RIPK3、p-RIPK3蛋白表达量

图5各组小鼠软骨RIPK3相对荧光强度表达量

3、讨论

KOA具有病程长、发病快、致残率高的特点，主要表现为膝关节僵硬、疼痛、肿胀、活动受限等症状[15]。KOA病情阶段性发展的关键原因在于膝关节慢性炎症导致的软骨持续损伤，且软骨组织修复障碍更加剧了长期炎症带来的关节退行性改变[16]。本研究通过DMM手术建立KOA小鼠模型，病理学形态观察显示，与空白组比较，造模组小鼠关节结构紊乱，各层结构部分缺损且不连续，炎症浸润明显，提示造模组小鼠软骨组织发生破坏，出现KOA典型病理改变。

坏死性凋亡是一种高度促炎的细胞死亡形式，参与炎症小体与细胞因子的激活程序，在肿瘤坏死因子等介质的诱导下，RIPK1发生磷酸化并募集RIPK3相互作用形成复合体，随后将RIPK3磷酸化并启动损伤相关分子模式，并释放TNF-α、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6等炎症因子，使细胞外警报素增加，将巨噬细胞募集至局部区域，从而促进炎症发生[17-18]。有研究指出，当发生坏死性凋亡时，关节软骨中分解代谢因子表达上调，合成代谢因子表达下降，这些均会导致KOA软骨破坏，因此针对RIPK1/RIPK3通路的研究成为了骨关节炎疾病的关注重点[19]。Gong等[20]研究认为，AZ-628可以通过降低RIPK3活性，调控软骨细胞坏死性凋亡，从而抑制软骨细胞分解。另有研究人员使用IL-1β诱导软骨细胞坏死性凋亡，并通过Selumetinib抑制RIPK1/RIPK3通路，实验发现经药物干预后的软骨细胞基质合成增加，炎症环境改善[21]。本研究免疫荧光、qPCR及WB结果显示，造模组小鼠关节软骨坏死性凋亡通路相关蛋白及mRNA表达显著上升，RIPK3荧光强度显著提高，提示KOA小鼠软骨细胞发生坏死性凋亡。有研究指出TNF-α、IL-1β、IL-6是诱导坏死性凋亡的关键因子，也是细胞发生坏死性凋亡的下游环节[22-23]。本研究qPCR及ELISA检测结果亦表明，造模组小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平较空白组升高，提示KOA小鼠出现炎症反应，且为坏死性凋亡的继续发生提供诱导因素。

桂枝是中医经典方剂中最常使用的药物之一，在临床常用于治疗关节痹痛、风寒感冒、痰饮水肿等病证，且在关节病、心血管病、炎症性疾病中具有极佳疗效[24]。Park等[25]研究发现，桂枝提取物具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、镇痛等，其中的苯丙素类化合物、单萜类化合物、甾醇等对炎症反应具有治疗作用。桂枝活性成分中，肉桂酸可以降低小鼠外周循环中的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)含量，抑制全身炎症[26];肉桂酸苄酯具有抗高血压、抗菌、抗氧化等功效，体外实验发现，肉桂酸苄酯显著减少TNF-α诱导的滑膜成纤维迁移，同时对线粒体介导的细胞凋亡具有抑制作用[27];桂枝中的乙酸乙酯提取物可以增加血清中的干扰素-γ水平，减少肺组织中的中性粒细胞数量，抑制NLRP3炎症小体表达，对肺、脾等组织病变具有保护作用[28]。本研究结果显示，在使用坏死性凋亡抑制剂及桂枝干预后，小鼠软骨组织损伤较模型组改善，坏死性凋亡通路相关mRNA及蛋白表达显著下降，RIPK3荧光强度明显降低，各炎症因子大量减少，提示桂枝可以调控RIPK1/RIPK3通路，改善炎症环境，缓解软骨组织病变，对KOA小鼠膝关节起到保护作用。Nec-1为坏死性凋亡抑制剂，桂枝高剂量组小鼠与Nec-1组小鼠各项检测指标可以达到相同水平，进一步证实桂枝可以减少细胞坏死性凋亡，实现对KOA关节软骨的保护作用。但在本实验中，尚缺体外实验验证及药物有效成分研究，希望在今后实验中深入探索。

综上所述，本文通过动物实验发现，KOA小鼠软骨细胞发生坏死性凋亡，释放大量炎症因子，造成关节软骨破坏，而桂枝可以通过下调RIPK1/RIPK3通路的表达，抑制软骨坏死性凋亡程序并改善全身及软骨局部炎症环境，延缓KOA软骨退变，保护膝关节功能。

参考文献:

[1]徐浩,肖涟波,翟伟韬.膝骨关节炎中西医结合诊疗专家共识[J].世界中医药,2023,18 (7):929-935.

[2]冯晓晴,蔡道章,余星磊,等.基于GBD大数据中国膝骨关节炎疾病负担现状与趋势分析[J].现代预防医学,2022,49(10):1753-1760.

[7]曾艳霞,朱霞石,陈丽,等.桂枝及其配伍药的化学成分及生物活性研究进展[J].安徽农业科学,2021,49(21):3-6.

[8]王培民.王培民效方治验:膝痹宁方[J].江苏中医药,2021,53(2):5-6.

[9]靳永亮,陈冠宜,刘文琴,等.桂枝化学成分研究[J].广西植物,2022,42(5):860-865.

[10]林雪妹.桂枝､夏枯草水提物体外抗寨卡病毒药效评价研究[D].广州:广州中医药大学,2022.

[11]揭立士,时孝晴,刘子修,等.桃仁-红花通过抑制NF-κB信号通路改善IL-1β诱导的软骨炎症和降解[J].中药新药与临床药理,2023,34(7):936-947.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82274545);江苏省医学重点学科/实验室建设单位项目(JSDW202252);江苏省中医院科主任学术提升专项(Y2022ZR26);

文章来源:苏子珊,陈拓,廖太阳,等.桂枝调节RIPK1/RIPK3信号通路干预KOA小鼠软骨坏死性凋亡[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(10):1420-1425+1465.