痛风性关节炎（goutyarthritis，GA）是一种由于饮食摄入过多或体内嘌呤类物质代谢紊乱以及尿酸排泄障碍，致使体内血尿酸浓度超过饱和，尿酸钠晶体析出并沉积在关节腔，诱发关节及其周围组织炎症的慢性代谢性炎症疾患[1]。该病急性期具有发病急骤、关节处红肿疼痛，疼痛剧烈，严重时可影响睡眠，病变部位及周围触之皮温增高等特征。最常累及第一跖趾关节、足跟、踝关节等部位，迁延日久会造成骨侵蚀，软骨基质的破坏，形成痛风石，可以并发肾脏疾病，严重影响患者的生活质量，甚至有一定概率致残[2]。据流行病学统计，我国痛风患病率高达13.3%，且呈逐年上升、年轻化趋势[3]。

目前，临床治疗痛风性关节炎以对症治疗、缓解临床症状为主，常用非甾体抗炎药以抗炎止痛，别嘌醇、非布司他抑制尿酸形成，苯溴马隆促进尿酸排泄，碳酸氢钠片碱化尿液等。虽可以迅速缓解症状，但病情易反复，还可造成胃肠道损伤，并有一定肝肾毒性[4]。中医药对痛风性关节炎的治疗疗效显著，且副作用少。苓泽合剂为辽宁中医药大学附属第二医院风湿科临床经验方，组成为：土茯苓、泽泻、苍术、黄柏等9味中药，苓泽合剂对痛风性关节炎的抗炎止痛、尿酸排泄以及防护软骨破坏等多方面取得显著临床疗效。

基质金属蛋白酶3（matrixmetalloproteinases3，MMP-3）是MMPs的成员之一，在肌肉骨骼系统中，MMP-3异常可导致软骨基质退化和滑膜增生等病理变化[5]。李倩等[6]通过对比有无骨侵蚀痛风性关节炎患者，评估得出血清MMP3水平与痛风性关节炎患者骨侵蚀的发生密切相关，且对痛风骨侵蚀具有潜在预测价值，是影响痛风骨侵蚀的独立危险因素。

前期实验已证明，苓泽合剂可以通过抑制白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）、前列腺素E2（prostaglsndinE2，PGE2）等炎性因子的表达治疗痛风性关节炎，但苓泽合剂对于患者关节软骨治疗的作用机制还尚未明确[7-8]。

本研究通过建立痛风性关节炎大鼠模型，探讨苓泽合剂对关节病理损伤及血清MMP-3的影响，从而明确苓泽合剂在痛风性关节炎关节软骨治疗中的疗效和作用机制。

1、实验材料

1.1实验动物

70只SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。饲养环境：温度20～23℃，湿度50%～60%。本研究已经本院动物伦理委员会批准（伦理编号：2023019）。

1.2实验仪器

莱卡石蜡切片机切，高分辨率荧光显微镜（THUNDERimageDM4B，JD801），形态图像分析系统，SoftMax酶标仪（批号：SMP500-14652-PNPQ），电热鼓风干燥箱（批号：BGZ-140），ThermoFisher高速冷冻离心机购于塞默飞世尔科技（中国）有限公司（批号：42591597）。

1.3实验药品与试剂

1）苓泽合剂药物组成：土茯苓、泽泻、川黄柏、苍术、知母、当归、黄芪、白芍、红花。痛风定胶囊（四川升和药业股份有限公司，批准文号：国药准字Z10970025）；依托考昔片（杭州默沙东制药有限公司，批准文号：国药准字HJ20181027，国药准字HJ20181031）；尿酸钠（美国Sigma公司，批号BCCF5862）。

2）病理部分：多聚赖氨酸（北京索莱宝科技有限公司，货号P2100）；柠檬酸钠抗原修复液（50x）（北京索莱宝科技有限公司，货号C1032）；EDTA抗原修复液（荧光50x）（北京索莱宝科技有限公司，货号C1034）；1xPBS缓冲液（pH7.2～7.4）（北京索莱宝科技有限公司，货号P1020）；封闭山羊血清（原液）（北京索莱宝科技有限公司，货号SLO38）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号G1120）；改良Harris苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号G1150）；DAB显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号DA1010）；抗荧光衰减封片剂（含DAPI）（北京索莱宝科技有限公司，货号S2110）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司，货号T1320）；甘油明胶封片剂（北京索莱宝科技有限公司，货号S2150）。大鼠MMP-3ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号ml002956）。

2、实验方法

2.1苓泽合剂溶液的制备

将苓泽合剂原方（土茯苓、泽泻、川黄柏、苍术等药）按照常规煎药方法进行2次煎煮、浓缩至0.41625g·mL-1、0.8325g·mL-1、1.665g·mL-1，装入专用中药汤剂包装袋中置于4℃冰箱冷藏备用。

2.2痛风性关节炎大鼠模型建立及给药

随机分为空白组10只、模型组60只。将模型组按照吕军等[9]提出的改良痛风性关节炎造模方法，用3%氧嗪酸钾溶液1mL·100g-1行腹腔内注射，每日2次，空白组相同方式注射等体积生理盐水，连续注射1周后，大鼠目内眦静脉采血测量血尿酸水平，验证高尿酸血症模型。高尿酸血症成模后，将模型组随机分为模型组、苓泽合剂低剂量组（4.1625g·kg-1）、中剂量组（8.325g·kg-1）、高剂量组（16.65g·kg-1）、依托考昔组（5.4mg·kg-1）、痛风定组（0.432g·kg-1），各10只。各给药组按相应剂量给药3d，第4天用10%水合氯醛（0.3mL·100g-1）对各组进行腹腔注射麻醉，用6号注射针在各组右侧踝关节后侧沿跟腱内侧以30～40°方向插入至关节腔，将30μLMSU混悬液注入到关节腔内，空白组腹腔及右踝关节腔注入等体积生理盐水，造模后适当外涂红霉素软膏预防感染。

2.3Elisa法检测各组大鼠血清中MMP-3表达水平

造模成功后，腹主动脉取血，室温下静置30min后，3500r·min-1离心15min，取上清液，酶联免疫吸附法（Elisa）测定血清中MMP-3浓度。

2.4大鼠踝关节病理形态学观察

造模成功后，取各组右侧踝关节滑膜组织，通过4%多聚甲醛进行固定，固定后按照脱钙、脱水浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色等步骤依次进行，最后置于光镜下观察组织病理形态学变化。

2.5免疫细胞化学技术检测

各组大鼠关节软骨中MMP-3表达大鼠踝关节切片进行去蜡与修复后，用磷酸盐缓冲（phosphatebufferedsaline，PBS）清洗，并应用过氧化物酶进行封闭。PBS清洗后在1%山羊血清的PBS稀释的一抗中孵育。样品用PBS清洗后室温下孵育二抗。孵育后将切片浸入新鲜的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液显色，阳性信号通过ImageJ软件进行分析。

2.6统计学方法

实验数据经GraphpadPrism10.1.2软件予以分析处理，数据呈现形式为（x±s）。于组间比较时，针对计量资料，首先实施正态性与方差齐性检验。若满足方差齐性条件，则运用OnewayANOVA展开方差分析；若不满足方差齐性，则采用非参数法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组血清中MMP-3表达情况比较见表1，图1。

表1各组血清中MMP-3表达情况比较

图1各组血清中MMP-3表达

3.2苓泽合剂对大鼠软骨组织病理变化影响

在大鼠软骨组织的病理变化方面，空白组的关节软骨面保持完整，未出现血管扩张充血、黏膜肿胀、炎症细胞浸润、绒毛状增生、血管翳形成以及组织坏死等情况。而模型组的关节软骨面则呈现出明显的组织形态紊乱，存在血管充血扩张现象，并且有大量炎症细胞浸润，部分组织甚至发生了坏死。依托考昔组关节软骨处血管充血、炎细胞浸润、组织坏死等情况得到明显改善。经苓泽合剂治疗后，低、中、高组病变组织处均得到改善。苓泽合剂中、高剂量组疗效接近依托考昔组，优于痛风定组、苓泽合剂低剂量组和异甘草素组。见图2。

图2苓泽合剂对痛风性关节炎大鼠模型关节软骨组织病理形态学影响

3.3免疫组化检测各组关节软骨中MMP-3表达情况

与空白组相比，模型组关节软骨中MMP-3含量明显增高，通过免疫组化染色后呈棕色。如图3所示，苓泽合剂组及阳性药组均可降低关节软骨中MMP-3含量，中、高剂量的苓泽合剂组与依托考昔组对降低关节软骨中MMP-3表达优于痛风定组、苓泽合剂低剂量组。见图4。

图3苓泽合剂对痛风性关节炎大鼠模型关节软骨组织MMP-3表达的影响

图4各组关节软骨中MMP-3表达

4、讨论

痛风性关节炎的发病率随着生活水平的提升和生活习惯、饮食结构的变化而逐年上升，并且呈现出年轻化的趋势。迁延不愈或失治后可导致尿酸盐沉积过多，形成痛风石，还可能损害肾脏和关节软骨，甚至造成残疾。因此，痛风性关节炎的防治问题已经引起了广泛关注。

研究[10]表明，痛风性关节炎发病机制是尿酸钠结晶在关节腔内析出后，巨噬细胞将其吞噬，释放炎症因子前体，募集中性粒细胞透过毛细血管基底膜，吞噬尿酸钠结晶，并释放大量炎症因子，引起一系列炎症反应。炎症细胞浸润以及尿酸盐沉积，都会造成软骨的损伤，软骨损伤是痛风性关节炎的早期病理改变[11]，影像学也可以证实骨侵蚀与炎症细胞浸润和软骨基质降解密切相关[12]。

MMP-3是一种高度依赖锌离子结构的同源性内切蛋白酶家族，是细胞外基质降解的重要途径，自1962年于蝌蚪尾部发现后，现已发现的有28种，其中与软骨代谢过程密切相关的有3种，分别为胶原酶、明胶酶、间质溶解素[13]。

MMP-3属于间质溶解素范畴，是组成基质溶解素重要成分之一，在结构上，MMP-3包含一个氨基末端前肽区、一个氨基末端催化区和一个羟基末端结构域，主要作用于蛋白聚糖、纤维连接蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白，基底膜部分等的降解，引起基质降解改变，造成软骨骨质破坏，并可通过激活MMP-1、MMP-9、MMP-13，加速降解过程，加剧软骨破坏程度[5]。同时，MMP-3在酸性条件下作用力更强，而痛风性关节炎刚好给MMP3提供了适宜的酸性环境[14]。并且MMP-3的激活与发挥作用受多条炎症通路的调控，包括核因子-κB（nuclearfactorkappa-B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）等信号通路[15]。当炎症通路激活后，释放大量作为炎症趋化因子和激活因子的IL-6和TNF-α可诱导其他细胞因子、MMP-3的产生[16]，并可以使MMP-3表达升高，从而加剧炎症反应，促进软骨组织的破坏。

前期动物实验已验证，苓泽合剂可以很好地抑制痛风性关节炎大鼠模型血清中IL-6、TNF-α的表达，使苓泽合剂对痛风性关节炎起到治疗作用。而造成软骨破坏的因素与IL-6和TNF-α诱导的MMP-3密不可分。

本次研究发现，模型组关节软骨组织血管出现充血扩张现象，同时有大量炎症细胞浸润，导致软骨组织部分坏死。此外，血清中MMP-3的水平显著升高，这可能与软骨组织的破坏和炎症反应有关。机体受到关节腔中的MSU晶体刺激后，调控炎症信号通路，释放大量炎症因子，同时提高MMP-3表达水平，提高对细胞外基质的降解能力，进而导致关节软骨严重受损。苓泽合剂低、中、高剂量组与模型组相比，血液中MMP-3水平明显降低，关节软骨组织血管充血、炎症细胞浸润以及组织坏死程度对比模型组有不同程度的减轻，证明苓泽合剂可以通过抑制MMP-3的表达，减少对关节软骨的破坏。其中苓泽合剂中剂量组疗效优于苓泽合剂低剂量和苓泽合剂高剂量组。

中医对痛风的记载最早可追溯到《黄帝内经》，因痛风临床表现，多将GA归属于中医的“痹症”，《素问·痹论篇》有云：“风寒湿三气杂至合而为痹，……湿气胜者为着痹”，指出是外界风、寒、湿邪相互交杂侵袭，阻滞经脉，从而导致气血运行不畅，不通则痛，肌肉、筋骨、关节发生疼痛不适[17]。痛风这一病名的正式提出是陶弘景在《名医别录》所著：“百节痛风无新久者”[18]，朱丹溪在此基础上首设“痛风”章节。此外还有“白虎历节”“历节”等病名。痛风发病多责之于先天禀赋不足，脾肾亏虚，加上后天饮食不节，湿浊内生，瘀阻于经络，日久蕴而化热，不通则痛，此为痛风急性发作的重要机制[19]。目前临床上常见的痛风性关节炎患者多为急性期，以关节红肿热痛，得凉则舒等症状为主。苓泽合剂在临床治疗中显示出良好疗效，凭借其清热利湿、化瘀通络止痛之效，有效缓解了上述症状。

苓泽合剂由土茯苓、泽泻、川黄柏、苍术、知母、当归、黄芪、白芍、红花等组成，此方以土茯苓和泽泻这一祛湿泄浊常用药对为君药，共奏清热利湿，化浊解毒，通利关节之功效。土茯苓性味甘、淡、平，归肝、胃经，具有清热除湿解毒、通利关节之效，《冯氏锦囊秘录》中记载：“俗名冷饭团。……甘淡而平，阳明主药，厘清祛浊，祛风除湿，筋骨拘挛，……去湿化毒之要药也，胃虚肾寒者禁之”[20]。泽泻为“除湿之圣药”，味甘，性寒，归肾、膀胱经，有利水渗湿泄热功效，《景岳全书》记载：“味甘淡微咸，气微寒。气颇厚，沉而降，阴也，阴中微阳。入足太阳、少阳。其功长于渗水去湿，故能行痰饮，止呕吐泻痢，……，脚气肿胀，引药下行”[21]。知母、苍术和川黄柏为臣药，苍术、黄柏为治疗湿热下注的基础方二妙散的组成部分。黄柏味苦性寒，《本草纲目》中记载，黄柏可“泻膀胱相火，补肾水不足，坚肾壮骨髓，疗下焦虚，诸痿瘫痪，利下窍，除热”[22]。取其味苦味以燥湿，其性寒以清热，同时兼有泻火除蒸，解毒疗疮之功用，走下焦以清下焦之湿热。苍术味辛苦性温，具有燥湿健脾，祛风散寒，名目之功效[23]，加强君药燥湿的功效，在此基础上健运脾胃，防止脾胃的运化功能失司，导致水液不运，生湿化热，从源头上解决问题。其中知母味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，有清热泻火、滋阴润燥之功，在去除热邪的同时兼顾养阴。当归、红花共为佐药，增强活血化瘀之力，使湿浊日久所致瘀血得以消散，通络止痛[24]。生姜、白芍配伍为使药，辛散与酸收并用，调和营卫。君臣佐使配伍使用，使湿邪得化，热邪得祛，瘀血得散，经络得通，痛风得治。

综上所述，MMP-3可以引起基质降解造成痛风性关节炎患者软骨骨质的破坏，苓泽合剂可以降低MMP-3在机体中的表达可以有效减轻软骨破坏情况，有望成为痛风性关节炎治疗及软骨防护治疗的新药剂，但其机制仍需进一步研究。本研究为临床应用提供了实验依据，为痛风在临床上诊治提供了新方向。但接下来还需要深入到细胞、分子层面，采用更先进的生物技术去精准探究苓泽合剂对相关炎症因子及MMP-3基因表达和信号转导的具体调控机制，对苓泽合剂治疗急性痛风性关节炎的作用机制进行全面、系统的研究，为深入理解其作用机制提供更丰富的数据支持。

参考文献:

[1]中国中西医结合学会风湿类疾病专业委员会.痛风及高尿酸血症中西医结合诊疗指南[J].中医杂志,2023,64(1):98-106.

[2]方宁远,吕力为,吕晓希,等.中国高尿酸血症相关疾病诊疗多学科专家共识(2023年版)[J].中国实用内科杂志,2023,43(6):461-480.

[4]刘维.痛风及高尿酸血症中西医结合诊疗指南[J].中医杂志,2023,64(1):98-106.

基金资助:辽宁省科学技术计划项目(2022JH2/101300047);沈阳市科学技术计划项目(24-214-3-180);第五批全国中医临床优秀人才项目(国中医药人教函[2022]1号);第一批辽宁省中医临床优秀人才项目(辽卫发[2021]7号);辽宁省闫也名中医工作室建设项目(2024);

文章来源:高志鹏,赵用,孔德花,等.苓泽合剂对痛风性关节炎大鼠模型MMP-3表达的影响[J].长春中医药大学学报,2025,41(07):750-755.