骨缺损可能对机体的形态及功能产生影响，严重影响患者的心理和身体健康，而骨质疏松对于骨缺损修复的影响是一大难题[1]。目前骨缺损修复方式均存在自体骨来源有限、免疫排斥、传播疾病的风险及生物活性低等问题[2]。积雪草苷(AS)提取自中药积雪草，可促进骨髓间充质干细胞成骨分化[3]。SDF-1广泛表达于各种细胞，其与CXCR4受体结合可以促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化[4]。本研究主要探索积雪草苷对脂多糖(LPS)诱导的MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化及SDF-1/CXCR4信号通路的影响。

1、材料和方法

1.1实验细胞

小鼠MC3T3-E1成骨细胞购于上海赛百慷生物公司。

1.2主要药物

积雪草甘标准品(≥98%,SA8540)和脂多糖(≥98%,L8880)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3主要试剂与仪器

Hoechst 33258染色液(C1017)购于上海碧云天公司；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(LG-TE0003)购于上海羽哚生物公司；茜素红染色试剂盒(CTCC-JD001)购于无锡菩禾生物医药公司；COL-Ⅰ(ab270993)、骨桥蛋白(OPN,ab218237)、骨钙素(OCN,ab309521)及SDF-1(ab25117)、CXCR4(ab181020)一抗均购于英国abcam公司；SpectraMax iD3型多功能酶标仪购自美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.4细胞培养

MC3T3-E1成骨细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃下5%CO2培养箱中培养，将细胞培养至对数生长期用于后续实验。

1.5细胞活性实验

将MC3T3-E1成骨细胞接种于96孔板，成骨分化诱导培养基培养24 h,用2 mg/L脂多糖[5]处理MC3T3-E1成骨细胞24 h,再用5,10,20,40,80μmoL/L积雪草苷处理脂多糖诱导的MC3T3-E1成骨细胞24 h,加入CCK-8试剂，酶标仪测定450 nm处的吸光度值，检测细胞活性。

1.6细胞处理及分组

将MC3T3-E1成骨细胞分为对照组(Control组)、脂多糖组(LPS组)、积雪草苷低、中、高浓度组(AS-L、AS-M、AS-H组)、积雪草苷高浓度+CXCR4抑制剂AMD3100组(AS-H+AMD3100组)[6]。对照组不做任何处理；脂多糖组用2 mg/L脂多糖处理24 h; AS-L、AS-M、AS-H组用2 mg/L脂多糖处理24 h后分别用10,20,40μmoL/L积雪草苷处理24 h; AS-H+AMD3100组用2 mg/L脂多糖、40μmoL/L积雪草苷及60μmoL/L AMD3100依次分别处理24 h。

1.7指标检测

1.7.1 Hoechst 33258染色

将各组MC3T3-E1成骨细胞接种于96孔板，37℃、5%CO2环境下在成骨分化诱导培养基培养12 h,弃去培养基，PBS冲洗后加入4%多聚甲醛固定，加入Hoechst 33258染色，PBS漂洗后荧光显微镜观察细胞核形态。

1.7.2碱性磷酸酶活性检测

将各组细胞接种于96孔板成骨分化诱导培养基培养7 d,弃培养液，并用PBS洗涤，一部分加入碱性磷酸酶显色剂避光染色30 min,光学显微镜观察并拍照。另一部分加入0.1% Triton X-100裂解细胞30 min,反复吹打至细胞完全裂解，收集裂解液，4℃下12 000 r/min离心15 min,收集上清液。按照碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明书进行操作，检测碱性磷酸酶活性。

1.7.3茜素红染色

将各组细胞接种于96孔板成骨分化诱导培养基培养21 d, PBS漂洗，加入4%多聚甲醛固定30 min,弃固定液，PBS洗涤，加入茜素红染色液染色30 min,弃茜素红染液，PBS洗涤至液体颜色不变红，显微镜下观察钙结节形成并拍照。

1.7.4免疫印迹

将各组细胞接种于96孔板中，成骨分化诱导培养基培养7 d,加入RIPA细胞裂解液裂解蛋白，4℃下6 000 r/min离心10 min,取上清，检测蛋白浓度。对各组蛋白分别进行凝胶电泳分离、转膜封闭2 h,分别加入兔抗COL-Ⅰ、OPN、OCN、SDF-1、CXCR4一抗4℃孵育过夜，随后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育，最后加入ECL化学发光液显色，检测COL-Ⅰ、OPN、OCN、SDF-1、CXCR4蛋白表达情况。

1.8统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，计量资料符合正态分布以x¯±s

形式描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组MC3T3-E1成骨细胞活性比较

与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞存活率显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，10,20,40,80μmoL/L积雪草苷组MC3T3-E1成骨细胞存活率显著上升，差异有统计学意义(P<0.05);40μmoL/L积雪草苷组与80μmoL/L积雪草苷组MC3T3-E1成骨细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05),因此选择10,20,40μmoL/L积雪草苷进行后续实验，见表1。

2.2各组MC3T3-E1成骨细胞细胞核形态比较

表1各组MC3T3-E1成骨细胞活性比较(n=6,x¯±s)

对照组MC3T3-E1成骨细胞细胞核形态完整，染色均匀，呈圆形或卵圆形；与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞细胞核固缩深染，呈明显细胞凋亡形态；与脂多糖组比较，AS-L、AS-M、AS-H组MC3T3-E1成骨细胞细胞核固缩深染逐渐减轻，凋亡形态细胞逐渐减少；与AS-H组比较，AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞细胞核固缩深染加重，呈细胞凋亡形态细胞明显增多(见图1)。

图1 Hoechst 33258染色观察各组MC3T3-E1成骨细胞凋亡情况(×200)  

2.3各组MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶活性比较

与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶活性显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，AS-L、AS-M、AS-H组MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶活性依次显著上升，差异有统计学意义(P<0.05);与AS-H组比较，AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶活性显著下降，差异有统计学意义(P<0.05),见图2和表2。

图2碱性磷酸酶活性检测各组MC3T3-E1成骨细胞分化情况(×10)   

表2各组MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶 活性比较(n=6,x¯±s)

2.4各组MC3T3-E1成骨细胞成骨分化比较

与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，AS-L、AS-M、AS-H组MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成依次显著上升，差异有统计学意义(P<0.05);与AS-H组比较，AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成显著下降，差异有统计学意义(P<0.05),见图3和表3。

2.5免疫印迹检测MC3T3-E1成骨细胞COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达

与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，AS-L、AS-M、AS-H组MC3T3-E1成骨细胞COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达依次显著上升，差异有统计学意义(P<0.05);与AS-H组比较，AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05),见图4和表4。

图3茜素红染色检测各组MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成情况(×10)  

表3各组MC3T3-E1成骨细胞钙结节形成比较(x¯±s)

图4 Western Blot检测COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达  

表4各组MC3T3-E1成骨细胞COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达比较(n=6,x¯±s)

2.6免疫印迹检测SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白表达

与对照组比较，脂多糖组MC3T3-E1成骨细胞SDF-1、CXCR4蛋白表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);与脂多糖组比较，AS-L、AS-M、AS-H组MC3T3-E1成骨细胞SDF-1、CXCR4蛋白表达依次显著上升，差异有统计学意义(P<0.05);与AS-H组比较，AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞SDF-1、CXCR4蛋白表达显著下降，差异有统计学意义(P<0.05),见图5和表5。

图5 Western Blot检测SDF-1和CXCR4蛋白表达 

表5各组MC3T3-E1成骨细胞SDF-1和CXCR4蛋白表达比较(n=6,x¯±s)

3、讨论

骨质疏松可能导致骨量减少和骨骼结构改变，影响骨整合，而骨质疏松患者骨缺损修复仍是一大难题，目前主要通过材料填充进行缺损修复，其中包括自体骨、同种异体骨、脱钙骨基质、生物陶瓷、金属材料等，然而自体骨骨量有限，其他材料又有感染、传播疾病、免疫排斥和生物活性低等缺点[7]。因此，寻找新的药物促进骨再生成为研究重点，随着国家医药科技的发展，中医中药也不断受到重视，从不同的草本植物中提取活性化合物治疗骨缺损越来越广泛。积雪草苷是从中药积雪草中提取的一种三萜类皂苷化合物，具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤、促进伤口愈合、抑制瘢痕形成、免疫调节、成骨分化等作用[8]。研究显示积雪草苷可以减少促炎细胞因子的释放，抑制软骨细胞凋亡和炎症反应，抑制关节软骨退变，保护膝骨关节炎大鼠软骨避免损伤[9,10]。另外积雪草苷可以抑制破骨细胞的形成和骨吸收，对细胞成骨分化产生积极影响[11]。本研究显示积雪草苷可以促进MC3T3-E1成骨细胞增殖及钙结节形成，同样积雪草苷可以促进成骨细胞的成骨分化。

碱性磷酸酶能在成骨的过程中促进矿化，其活性被广泛认为是成骨细胞活性的生化标记物，碱性磷酸酶高表达是成骨细胞分化的早期标志，而钙结节形成标志成骨细胞进一步分化成熟，是成骨晚期的一种标志物[12]。研究显示碱性磷酸酶的活性升高及钙结节形成增多，可以促进骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化[13]。传统中药淫羊藿可以促进MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性，促进MC3T3-E1细胞的成骨分化[14]。本研究结果显示，积雪草苷升高了碱性磷酸酶的活性，促进钙结节形成，说明积雪草苷可以促进MC3T3-E1成骨细胞的成骨分化。

COL-Ⅰ、OPN、OCN均是参与骨形成及矿化的重要骨基质蛋白。COL-Ⅰ不仅能刺激细胞的黏附和成骨分化，还可以在骨形成过程中为骨细胞钙盐沉积提供场所[15]。骨桥蛋白可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，是早期成骨的标志之一。骨钙素是成骨细胞晚期分化的标志物，常用于检验成骨细胞活性。研究显示COL-Ⅰ、OPN、OCN表达升高，可以促进人牙龈成纤维细胞的增殖及成骨分化[16]。三七总皂苷能促进COL-Ⅰ、OPN、OCN等成骨相关蛋白表达，促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化[17]。本研究结果显示，积雪草苷可以升高COL-Ⅰ、OPN、OCN表达水平，说明积雪草苷参与MC3T3-E1成骨细胞的增殖分化进程。

SDF-1/CXCR4信号通路参与成骨细胞成骨相关蛋白的表达及骨形成过程，其中SDF-1即趋化因子CXCL12,其可以通过自身反馈促进自身的增殖及成骨分化等。CXCR4是一个由7个跨膜受体组成的家族成员，SDF-1与其结合可以引起一系列的信号转导，促进细胞的成骨分化。研究显示促进SDF-1和CXCR4蛋白表达，可以促进骨髓间充质干细胞黏附、迁移及成骨分化，促进骨缺损区域的骨愈合[18]。SDF-1α/CXCR4信号轴参与骨髓间充质干细胞早期成骨分化，其SDF-1和CXCR4表达升高可以提高细胞碱性磷酸酶活性[4]。本研究显示，积雪草苷可以升高SDF-1和CXCR4表达水平，推测积雪草苷可能通过调控SDF-1/CXCR4信号通路参与MC3T3-E1成骨细胞的增殖分化。为验证这一猜想，在积雪草苷高浓度处理MC3T3-E1成骨细胞的基础上进行AMD3100处理，结果显示AS-H+AMD3100组MC3T3-E1成骨细胞的碱性磷酸酶活性降低，钙结节形成减少，COL-Ⅰ、OPN、OCN蛋白表达降低，证实积雪草苷可通过调控SDF-1/CXCR4信号通路参与MC3T3-E1成骨细胞的增殖分化。

参考文献:

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[3]曹振宇,沈晓钟,马建武,等.积雪草苷通过TGF-β/Smads通路对BMSCs成骨分化的影响[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(5):695-700.

[4]白书林,王奕佩,金珂,等.SDF-1α/CXCR4信号轴介导柚皮素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].上海口腔医学,2021,30(6):579-584.

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[12]赵有顺,林平,涂迎春,等.RUNX2基因过表达载体修饰BMSC来源外泌体联合碳酸钙支架系统在骨缺损中的应用[J].中国骨伤,2022,35(4):379-386.

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文章来源:赵强,肖波,陈天逸,等.积雪草苷对脂多糖诱导的成骨细胞增殖和分化的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2024,32(07):24-28+33.