肥胖已成为危害公共健康的重要因素之一,目前在发展中国家也成为影响国民健康的焦点[1]。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)是2型糖尿病和肥胖早期重要的发病机制,食欲调节紊乱与胰岛素抵抗肥胖密切相关,下丘脑作为摄食中枢,对控制食欲、调节能量代谢起着重要的作用[2,3,4]。脑肠肽是由胃肠道分泌的,既分布在胃肠道,又存在于脑中的肽类物质的统称,中枢对脑肠肽敏感性的变化是导致肥胖的主要基础之一[5]。其中瘦素作为一种重要的饱食信号,通过中枢和外周两条途径共同参与机体的摄食行为和体重的调节,瘦素通路是重要的抗食欲信号通路[6]。近年来,针灸作为一种中医治疗方法,被广泛用于肥胖及其并发症的防治,取得了满意的疗效[7,8]。国内外研究者对针刺改善胰岛素抵抗和肥胖的机制进行了深入研究[9,10,11,12],结果显示,针刺可以促进脂质代谢、控制进食、缓解炎症以及调节胰岛素信号通路等多个环节来治疗肥胖和胰岛素抵抗。本研究以高脂饲料诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠脑肠肽瘦素中枢敏感性的改变为切入点,从调节食欲的角度进一步探讨电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠的效应以及可能机制。

1、材料与方法

1.1动物

SPF级Wistar雄性大鼠48只,8周龄,体质量(260±20)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,实验动物合格证号:211002300028524,适应性饲养1周。大鼠自由进食饮水,12h明暗周期,温度(22±2)℃,相对湿度(50±10)%。

1.2主要试剂及仪器

2%戊巴比妥钠(德国Sigma公司,批号:20110511);胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉Elabscience公司,货号:E-EL-R2466c);2%的利多卡因注射液(批号:1708283)、0.9%氯化钠溶液(批号:E118052804),山东华鲁制药有限公司;胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司,批号:B1810292);4%多聚甲醛溶液(Biosharp公司,货号:BL539A);瘦素酶联免疫试剂盒(AndyGeneBiotechnology公司,货号:E-EL-R2556a);ECL显影液(美国Bio-Rad公司,货号:170-5060);BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0010S)、蛋白裂解液(货号:P0013),武汉碧云天生物技术有限公司;兔抗磷酸化信号转导因子和转录激活因子3(p-STAT3)抗体标准品(美国CST公司,货号:9145);p-STAT3免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:PV-9000)。

环球牌针灸针(0.3mm×20mm,苏州针灸用品有限公司);HANSLH202H型电针治疗仪(北京华威科技有限公司);WZ-50C6型双数字式微量注射泵(上海软隆科技发展有限公司);SF-400A型精密电子秤(上海志荣电子科技公司);Axiovert40CFL型显微镜(德国ZWISS公司);HMIAS-2000型高清晰度彩色病理图像分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)。

1.3分组及造模方法

48只SD大鼠按照随机数字表法抽取8只设为正常组并喂以普通饲料,普通饲料由武汉春龙实验动物经营部提供,批号:20161022,总热能3.8kcal/g(含70%碳水化合物,20%蛋白质,10%脂肪)。其余40只大鼠均喂以高脂饲料8周建立胰岛素抵抗肥胖模型大鼠[13],高脂饲料由武汉春龙实验动物经营部提供,批号:20170714,总热量5.4kcal/g(38.5%碳水化合物,15%蛋白质,46.5%脂肪),以大鼠体质量高于普通饲料喂养大鼠体质量平均值的20%以上作为肥胖标准[14]。再将符合肥胖标准的大鼠进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹术[15]以检测全身胰岛素敏感性,以正常组大鼠葡萄糖输注速率(GIR)平均值作为标准,若所测大鼠的GIR小于标准值20%以上则认定为胰岛素抵抗[16]。将造模成功的大鼠24只按随机数字表法分为模型组、电针组、假电针组,每组8只。

1.4干预方法

正常组给予普通饲料喂养,不予任何处理。模型组给予高脂饲料继续喂养,不予任何处理。电针组给予高脂饲料喂养,采用电针治疗,取穴:“丰隆”“中脘”“关元”“足三里”。采用0.30mm×20mm不锈钢毫针针刺,“足三里”“丰隆”均直刺入3～5mm,“关元”向剑突方向,“中脘”向耻骨联合方向斜刺3～5mm。采用HANSLH202H型电针治疗仪,2Hz、1mA、连续波。“关元”和“中脘”连接同一输出的两个电极,同侧“足三里”和“丰隆”连接另一输出的两个电极。每次电针30min,隔日1次,每周治疗3次,总疗程为8周。假电针组给予高脂饲料喂养,给予穴位旁浅针刺,毫针刺入大鼠穴位旁边5mm的皮下后,夹持电极,不予通电,其余同上述电针方法。各组均干预8周。以上选用的电针参数均参考文献[17]并进行前期预试验后决定。

1.5观察指标及方法

1.5.1体质量及24h进食量检测

用电子秤在干预前及干预2、4、6、8周后分别测量所有大鼠的体质量及24h进食量。24h进食量为24h投食量减去剩余食量。

1.5.2胰岛素敏感性相关指标检测

干预结束后将大鼠禁食12h,自由饮水,2%戊巴比妥钠0.2ml/100g腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,室温下静置20min后,1000r/min离心10min,离心半径7cm,取上层血清保存。1)取血清2ml,参照试剂盒方法测定血清胰岛素含量。2)GIR[15]:大鼠禁食8h后以2%的利多卡因注射液0.5ml于大鼠尾根部行环状皮下注射以局部麻醉,分别进行尾动静脉插管。将尾静脉连接的小三通管的一个通道连接浓度为50mU/ml的胰岛素注射液,另一个通道连接30%葡萄糖注射液。胰岛素和葡萄糖均采用双数字式微量注射泵泵入。在尾动脉取血0.5ml,用以检测上泵前的血糖,以此作为基础血糖。随后监测血糖:以0.12U/(kg·h)恒定速度泵入胰岛素5min,再次取动脉血10μl测量血糖,当血糖低于基础血糖0.5mmol/L时,开始输入30%葡萄糖注射液。随后每5min测量血糖1次,及时调整葡萄糖输入速度,使血糖在基础血糖±0.5mmol/L的范围内波动。60min后如果连续3次测得的血糖均在上述范围内,则认为达到稳态,测量此时的血浆胰岛素。继续上述过程,连续监测血糖12次,以实验达到稳态后的12次葡萄糖输注速率求平均值。

1.5.3血清瘦素含量检测

取血清2ml,采用酶联免疫试剂盒按照说明书方法测定血清中瘦素水平。

1.5.4瘦素中枢敏感性相关指标测定

采用免疫组化的方法测定迷走神经传出神经元(迷走运动背核和疑核)中瘦素诱导p-STAT3表达。腹主动脉取血后,用0.9%氯化钠溶液从心尖快速冲灌,直至肝脏及双眼变白、右心耳流出清亮液体,再以4%多聚甲醛溶液灌注,先快后慢,直到大鼠抽搐,肝脏变硬,大鼠尾部变硬即结束灌注,快速断头取脑,4%多聚甲醛溶液中固定过夜,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋,在延髓第四脑室正中孔下方按大鼠脑定位图谱进行切片。免疫组化法具体操作按照试剂盒要求进行。每个样本随机选取5个视野,用Image-ProPlusVersion7.0软件进行图像分析。

采用免疫印迹法测定节状神经节和弓状核中p-STAT3蛋白表达。腹主动脉取血后,在颈部正中将皮肤切开,迅速分离暴露颈血管鞘,辨认迷走神经,摘除节状神经节。然后将大鼠断头取脑,并快速在冰上分离下丘脑弓状核。将神经节和弓状核在液氮中速冻后立即转入-80℃保存。采用蛋白裂解液裂解新鲜神经节和弓状核组织后提取总蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。每组取30μg上样,电泳后半干转膜仪中转膜,转膜条件以目的蛋白分子量为依据进行调整,之后放入5%牛奶中封闭1h,加入相应一抗,4℃侧摆摇床孵育过夜,次日加入二抗常温孵育1h,利用ECL显影液在凝胶扫描成像系统中显影,并利用Gel-Proanalyzer6.0软件分析目的条带的光密度值,以目的蛋白与内参蛋白光密度比值来说明各样品目的蛋白表达水平。

1.6统计学方法

采用SPSS22.0统计软件包进行统计学处理。计量资料属正态分布者以均数±标准差表示,采用单因素方差分析的LSD检验进行组间比较;属非正态分布者采用秩和检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠血清胰岛素含量、GIR、瘦素水平比较

表1示,与正常组比较,模型组大鼠血清胰岛素、瘦素水平明显升高,GIR水平降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组血清胰岛素、瘦素水平明显降低,GIR水平升高(P<0.01)。且电针组血清胰岛素、瘦素水平明显低于假电针组,GIR水平高于假电针组(P<0.01)。

表1各组大鼠血清胰岛素、GIR、瘦素水平比较

2.2各组大鼠不同时间体质量比较

表2示,与正常组同时间比较,模型组大鼠在0、2、4、6、8周时体质量明显增加(P<0.01)。与模型组同时间比较,电针组在6、8周时大鼠体质量降低(P<0.05或P<0.01),而假电针组在各时间点与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假电针组同时间比较,电针组大鼠在8周时体质量降低(P<0.01)。

2.3各组大鼠不同时间24h进食量比较

表3示,与正常组同时间比较,模型组大鼠在0、2、4、6、8周时进食量明显增高(P<0.01)。与模型组同时间比较,电针组大鼠在4、6、8周时进食量明显降低(P<0.05或P<0.01);且电针组在6、8周时进食量亦明显低于假电针组(P<0.05或P<0.01)。

表2各组大鼠不同时间体质量比较

表3各组大鼠不同时间24h进食量比较

2.4各组大鼠迷走神经传出神经元中p-STAT3表达比较

表4示,与正常组比较,模型组大鼠疑核和背核中p-STAT3表达明显降低(P<0.01);与模型组与假电针组比较,电针组疑核和背核中p-STAT3表达明显升高(P<0.01)。

表4各组大鼠疑核、背核中p-STAT3表达比较

2.5各组大鼠节状神经节及弓状核中的p-STAT3蛋白表达比较

表5示,与正常组比较,模型组大鼠节状神经节及弓状核中的p-STAT3蛋白含量明显降低(P<0.01);与模型组和假电针组比较,电针组大鼠神经节及弓状核中的p-STAT3蛋白含量表达明显升高(P<0.01)。各组大鼠节状神经节和弓状核中的p-STAT3蛋白电泳图见图1。

表5各组大鼠节状神经节和弓状核中p-STAT3相对表达量比较

图1各组大鼠节状神经节和弓状核中的p-STAT3蛋白电泳图

3、讨论

肥胖在世界范围内广泛流行,目前,药物治疗肥胖往往需要长期服用,且这类药物种类不多,价格昂贵,副反应较大[18]。近年来,针灸越来越广泛地被用于肥胖等胰岛素抵抗相关性疾病的防治[19]。《仁斋直指方》曰:“肥人气虚生寒,寒生湿,湿生痰,……故肥人多寒湿”,指出了肥胖的病机以气虚为本,痰湿为标,因此在肥胖的治疗中也要注重扶正祛邪。故在治疗胰岛素抵抗肥胖时,常选关元、足三里穴分别以固护先天之肾气及后天脾胃之气;取中脘、丰隆穴以祛痰湿之邪。近30年来,此四穴被多次报道用于治疗肥胖及胰岛素抵抗,均取得较好的疗效[20]。

有研究[21]显示,肥胖者血清瘦素水平高于正常者,大多数肥胖患者存在瘦素抵抗;而瘦素抵抗又是导致肥胖的重要危险因素之一[22,23]。Cinti等[24]在正常人胃黏膜中检测到瘦素的mRNA和蛋白,瘦素作为胃肠激素,由胃肠道分泌后,经迷走神经传递至中枢(下丘脑与脑干),共同组成了食欲调节通路(瘦素-迷走神经传入-下丘脑与脑干)。目前认为,最主要的瘦素信号转导通路是酪氨酸激酶/信号转导转录激活因子(JAK/STAT)途径[25]。信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)为细胞生长的重要调节因子,STAT3蛋白发生磷酸化后的产物p-STAT3是其一种活化形式,瘦素诱导的JAK/STAT信号通路激活及下丘脑STAT磷酸化和STAT转录结合的水平被看作是瘦素信号的引发点,对瘦素抑制食欲和减重等作用至关重要[26]。研究[27]亦表明,胃黏膜瘦素不是通过上调受体数量而是通过增强受体后STAT3信号传导通路的活性发挥效应的。

本研究发现,电针组大鼠的进食量、体质量、血清胰岛素、瘦素水平均较模型组下降,GIR显著,迷走运动背核及疑核中p-STAT3表达显著升高,节状神经节和弓状核中的p-STAT3蛋白表达也显著升高,说明胰岛素抵抗肥胖者的体质量、进食量、瘦素抵抗及胰岛素敏感性的变化与中枢对瘦素的敏感性变化相关,这些结果与之前的研究[28,29]结果一致。而假电针组在整个干预过程中,与模型组差异不明显,表明穴位具有特异性效应,再次验证了该四穴对胰岛素抵抗的有效性。

综上所述,电针能有效减轻胰岛素抵抗肥胖大鼠的体质量,减少进食量,控制食欲,降低血浆瘦素水平,减轻瘦素抵抗,并改善瘦素中枢敏感性,这可能是电针减肥的有效分子机制之一。

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基金:国家自然科学基金(81774420)