细胞自噬是细胞内成分在自身溶酶体中组分降解后再利用的过程,正常状态下,机体自噬处于较低水平,但当外界条件(如饥饿、缺氧、感染等)或内部条件(如细胞器损伤等)发生变化时,自噬则被诱导发生。在病理状态下,自噬就像一把双刃剑,轻度的自噬在一定程度上可保护细胞免受有害条件影响;重度或快速的自噬则会诱导细胞程序性死亡,即自噬性细胞凋亡[1]。近年来,随着自噬功能对中枢神经系统影响研究的深入,研究[2]发现,自噬在保证神经元结构完整,维持神经系统功能正常发挥的过程中扮演着关键角色。下丘脑是中枢神经系统的重要组成部分,可通过神经调节反射弧结构中的传出神经作用于胰岛细胞,参与胰岛素的分泌,进而影响胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的发生发展[3],故下丘脑作为中枢IR发生的核心脑区[4],自噬活性对中枢胰岛素信号传导的影响机制的研究已成为胰岛素抵抗相关研究的重点和热点。大量研究[5,6,7]表明,参与IR的许多机制,如胰岛素信号转导障碍、线粒体功能损伤、内质网应激、游离脂肪酸等,都与细胞的自噬过程有关。因此,本研究基于高脂高糖饮食诱导的IR模型,以自噬活性为靶点,通过观察自噬活性指标(Atg1、Atg13、Beclin-1)及中枢胰岛素信号传导分子[糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)]的变化,阐释电针通过调控下丘脑自噬活性,影响中枢胰岛素信号传导,进而改善IR的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物与分组

45只SPF级8周龄雄性Wistar大鼠,体质量(280±20)g,购于湖北省实验动物研究中心[生产许可证号SCXK(鄂)2020-0018]。饲养于湖北中医药大学黄家湖校区实验动物中心,温度控制在22～26℃,相对湿度控制在45%～75%,遵循12 h/12 h明暗周期,所有大鼠均可自由摄食饮水。适应性饲养3 d后,随机分为两组,正常组(15只)和模型制备组(30只)。待造模成功后,再将模型制备组随机分为两组,即模型组(15只)和电针组(15只)。实验过程中对动物的处置均符合中华人民共和国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要仪器与试剂

RNA提取液(武汉赛维尔),异丙醇、三氯甲烷和TBST缓冲液(国药集团),BCA蛋白浓度测定试剂盒和RIPA裂解液(上海碧云天),蛋白marker(北京海利克思),小鼠单抗β-actin、HRP标记羊抗兔二抗和HRP标记羊抗小鼠二抗(武汉博士德),兔多抗p-gsk3b和兔单抗atg13(英国Abcam),兔多抗atg1和兔多抗beclin1(武汉三鹰)、ECL底物液(北京普利莱),高脂饲料(货号D12492)。

一次性无菌针灸针(0.30 mm×15 mm,苏州医疗用品厂有限公司),酶标仪、超微量分光光度计和酶联免疫吸附法试剂盒(美国Thermo),血糖测试仪(江苏鱼跃),离心机(湖南湘仪实验室),荧光定量PCR检测仪(美国Bio-rad),离心管和TIP头(武汉赛维尔),水平摇床(江苏海门其林贝尔),p H计(德国Metter-Toledo Gmb H)和电子天平(北京赛多利斯),电针治疗仪(南京济生)。

1.3 模型制备

正常组予标准啮齿类动物饲料喂养直至整个实验结束,自由饮用自来水。模型制备组大鼠予8周的高脂饲料(脂肪58.8%,蛋白质15.2%,碳水化合物26.0%)及10%的果糖水喂养后,进行尾静脉采血检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)。检测FBG和FINS前,大鼠禁食12 h。计算大鼠的胰岛素抵抗指数(insulin resistance index,IRI),IRI=[FPG(mmol/L)×FINS(m IU/L)]/22.5。当模型制备组大鼠IRI较正常组大鼠明显升高(P<0.001)时,提示IR模型构建成功[8]。造模成功后,正常组喂养不变,将模型制备组随机分为模型组(15只)和电针组(15只)。模型组和电针组继续采用高脂饲料和10%的果糖水喂养,直至整个实验结束。电针组有3只大鼠于造模过程中死亡。干预后,为保证各组别间误差最小,对正常组与模型组采用随机数字法各选取大鼠12只进行取材。

1.4 干预方法

造模成功后,正常组不予任何针刺干预,模型组不予任何针刺干预,电针组采取电针干预。电针干预方法具体如下。根据“标本配穴”法,取关元和足三里(双侧)为本穴,取丰隆(双侧)和中脘为标穴,参照《实验针灸学》[9]的标准进行定位;选用0.30 mm×15 mm不锈钢毫针,足三里和丰隆均直刺3～5 mm,关元穴选择向剑突方向斜刺3～5 mm,中脘穴选择向耻骨联合方向斜刺3～5 mm;采用韩氏电针治疗仪,同侧足三里和丰隆连接同一组电极,关元和中脘穴连接另一组电极,连续波,频率2 Hz,强度1 m A,通电时间10 min;每周针刺3次,共8周,直至实验结束。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 FBG、FINS和IRI

于造模成功后及干预后,即实验的第8周和第16周,均采用尾静脉采血的方式,对所有大鼠的FBG和FINS进行测量并记录,并计算IRI。

1.5.2 透射电镜下直接观察自噬小体的形态

前固定,剥离大鼠下丘脑,剪取1 mm×1 mm大小的大鼠下丘脑组织放入2.5%的成二醛溶液,4℃固定2～4 h。后固定,PBS溶液漂洗组织3次,每次15 min,后转入1%锇酸固定液固定2～3 h,再次用PBS冲洗3次,每次15 min。脱水,需要用不同浓度的乙醇进行室温脱水,依次按照30%乙醇(20 min)—50%乙醇(20 min)—70%乙醇(20 min)—80%乙醇(20 min)—95%乙醇(20 min)—100%乙醇(20 min)—100%乙醇(20 min)顺序进行,再置于100%丙酮30 min共3次。包埋和聚合,812包埋剂1:1室温4 h,812包埋剂1:2室温过夜,纯包埋液室温放置5 h后将其倒入包埋板中,组织样品插入包埋板,37℃烘箱过夜,包埋板放60℃烤箱聚合48 h,取出树脂标本。切片,超薄切片机进行切片,厚度约60 nm。染色,将铜网至于4%醋酸铀溶液中进行染色,时间30 min,超纯水清洗3次,再用0.5%柠檬酸铅溶液染色5 min,超纯水清洗3次,滤纸吸干,室温干燥过夜。电镜观察,采用透射电镜对切片进行图像采集,观察自噬体超微结构并进行分析。

1.5.3 采用real-time PCR技术检测3组大鼠下丘脑组织GSK3β、Atg1、Atg13、Beclin-1 m RNA表达水平

称取100 mg大鼠下丘脑组织,提取总RNA后检测RNA浓度及纯度,配制逆转录反应体系,进行逆转录反应,25℃5 min,42℃30 min,85℃5 s,将RNA转换成c DNA,上下游引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应程序,95℃10 min,95℃15 s,60℃60 s,40个循环。以GAPDH为内参,采用2﹣ΔΔCt法分析GSK3β、Atg1、Atg13、Beclin-1 m RNA相对表达量。 

表1 引物序列  

1.5.4 采用Western blot法检测大鼠下丘脑Atg1、Atg13、Beclin-1、p-GSK3β蛋白表达水平

取大鼠下丘脑组织,加200μL裂解液裂解(含2μL PMSF、2μL磷酸酶抑制剂),匀浆,裂解,离心,取上清,置于﹣20℃保存。BSA标准品稀释为浓度1μg/μL、0.8μg/μL、0.6μg/μL、0.4μg/μL及0.2μg/μL的标准蛋白,酶标仪测定OD值后计算蛋白浓度。金属浴95℃10 min,使蛋白变性。制备SDS-PAGE凝胶,上样、电泳、转膜。PVDF膜浸泡于5%脱脂奶粉,封闭2 h,(磷酸化蛋白用1%BSA封闭2 h)加入一抗(Atg11:1000,Atg13 1:1000,Beclin-1 1:1000,p-GSK3β1:1000,β-actin 1:500),4℃过夜,洗膜,封闭液稀释二抗(羊抗小鼠Ig G 1:10 000,羊抗兔Ig G 1:10 000),室温摇床孵育2 h,使用ECL工作液显色曝,扫描胶片。以β-actin为内参蛋白,用Bandscan软件分析目的蛋白的灰度值。

1.6 统计学分析

使用SPSS23.0统计软件对实验数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示,若符合正态分布及方差齐性,组间差异比较用单因素方差分析,两两比较用LSD检验;不符合正态分布或方差不齐时,组间比较用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。Graphpad Prism 9.4.0软件整理生成统计图。

2、结果

2.1 3组大鼠FPG、FINS和IRI水平变化比较

造模后,与正常组比较,模型制备组大鼠FPG、FINS和IRI均明显升高(P<0.05),表示造模成功,详见表2。干预后,与正常组比较,模型组和电针组大鼠FPG、FINS和IRI均升高(P<0.05);与模型组比较,电针组FPG、FINS和IRI均降低(P<0.05),详见表3。  

表2 造模后大鼠FPG、FINS和IRI水平比较    

表3 3组大鼠FPG、FINS和IRI水平比较  

2.2 透射电镜技术观察自噬体与自噬溶酶体变化

与正常组比较,模型组大鼠下丘脑出现大量功能障碍的自噬空泡,空泡中含有未降解的电子致密物,双层膜结构不完整。与模型组比较,电针组的双层膜结构完整,致密物减少。详见图1。

图1 各组大鼠下丘脑自噬小体电镜图(25k×)   

2.3 3组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、GSK3βm RNA表达比较

与正常组比较,模型组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、GSK3β表达均升高(P<0.05);与模型组比较,电针组Atg1、Atg13、Beclin-1、GSK3β表达均降低(P<0.05)。详见图2。

2.4 3组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、p-GSK3β蛋白表达比较

与正常组比较,模型组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、p-GSK3β蛋白表达均升高(P<0.05);与模型组比较,电针组Atg1、Atg13、Beclin-1、p-GSK3β蛋白表达均降低(P<0.05)。详见图3和图4。

图2 3组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、GSK3βm RNA表达比较  

图3 3组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、GSK3β蛋白表达  

图4 3组大鼠下丘脑组织Atg1、Atg13、Beclin-1、p-GSK3β蛋白表达比较  

3、讨论

胰岛素抵抗(IR)属中医学“消渴”范畴,多因素体阴虚、恣食肥甘、情志不遂、劳欲过度所致,其中平素饮食不节,过食肥甘厚味为主要病因[10]。本实验中8周的高脂高糖饮食喂养类似于长期“过食肥甘厚腻”,久之则中焦壅滞,运化失常,湿聚痰生,热积津伤,发为消渴。正如《素问·奇病论》所记载“肥者令人内热,甘者令人中满”。《太平圣惠方·卷五十三》亦记载“三消者……或为食肥美之所发也”。纵观胰岛素抵抗的发生发展,其病位主要在脾、胃、肾,以肥腻伤脾、痰湿内盛为标,以先天禀赋不足、正气亏虚为本[11]。故基于中医学对胰岛素抵抗病因病机的认识,本研究确立标本兼顾为治则,固护脾胃、培补正气的同时化痰消脂、祛邪除湿,标本同治以达到正盛邪退而病愈的目的。关元穴为任脉经之腧穴,又处足三阴经与任脉交会处,亦为元阴、元阳交关之所,有增益人体之元气、强身健体的功效;足三里穴为足阳明胃经之合穴、下合穴,且阳明经气血充盈,故针刺该穴可补益脾胃,调养气血,增强人体免疫力。二穴配伍以固先天之本,护后天之气,正气方可存于体内。丰隆穴为足阳明胃经之络穴,也被称为治疗痰疾之要穴,针刺该穴以调整气机使中土得运,痰湿自化;中脘穴属任脉腧穴,为八会穴之腑会,胃之募穴,故针刺中脘穴有通调脏腑之气,清除胃肠瘀滞的效用。二穴相配以行理气化痰,消滞降脂之治标功效。电针疗法对IR作用显著,可帮助IR患者提升对于胰岛素的敏感性[12]。本研究结果示,经8周针刺治疗后,电针组FPG和FINS降低,IRI明显降低,与之前的研究[13,14]一致。

自噬在诱导阶段主要通过ATG1复合物(Atg1,Atg13、ATG17/FIP200等)的介导,Beclin-1是自噬的常见标志蛋白之一,也常被用作自噬诱导的标志,Atg1、Atg13、Beclin1三者均为自噬体形成过程中重要的正向调控因子[15]。但自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。本实验透射电镜下自噬小体表现为双层膜囊泡结构。故本实验中胰岛素抵抗大鼠下丘脑Atg1、Atg13、Beclin-1表达增加,说明自噬活性增强,结合透射电镜技术观察自噬体与自噬溶酶体发现,模型大鼠下丘脑可见大量功能障碍的自噬空泡,空泡中含有未降解的电子致密物,双层膜结构不完整,提示胰岛素抵抗状态下,大鼠下丘脑自噬小体异常增加。经过8周电针干预后,电针组大鼠下丘脑Atg1、Atg13、Beclin-1表达降低,电镜显示空泡中的致密物有所减少,说明电针抑制大鼠下丘脑自噬水平。胰岛素抵抗会加剧氧化应激、细胞器损伤以及自噬活化状态[16,17]。针刺作为调控自噬相关蛋白表达及信号通路,改善疾病的有效方法之一,其对自噬的调节也有着双重作用,针刺不仅可以促进自噬,清除病理产物,而且还可以抑制自噬,抵抗不同疾病时期的细胞死亡[18]。研究[19]表明电针可通过调节Atg1、m TOR等自噬相关蛋白的表达来抑制创伤区皮层神经元自噬的过度活化,进而发挥脑保护作用。研究[20]表明电针实现减重效应,与激活大鼠白色脂肪组织中m TOR/P70S6K信号通路,抑制脂肪组织过度自噬有关。针刺通过上调或下调自噬相关通路和蛋白的活性直接促进或抑制自噬过程。目前,以调节自噬活性为靶点将为针刺作为一种良性刺激防治疾病的研究提供新思路。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种存在于所有真核细胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,分为α和β两种亚型,其中GSK3β富集于中枢神经系统,尤其在海马组织中表达丰富。近年国内外均有相关研究提出GSK3β的高表达与胰岛素敏感性降低呈相关性[21,22],当GSK3β活性异常升高,胰岛素信号传导削弱,体内糖的利用、糖原合成等过程则受到抑制,从而出现IR。目前,GSK3β抑制受损已成为外周组织和中枢神经系统胰岛素抵抗的既定特征,因此本实验在经8周治疗后检测GSK3β蛋白和m RNA的表达,以观察中枢胰岛素信号传导状况。本实验结果显示,与正常组相比,模型组大鼠GSK3βm RNA和蛋白表达上调,8周电针干预后,电针组GSK3β表达降低,说明电针干预中枢胰岛素信号传导。

本实验中长期的高脂高糖饲养成功诱导IR模型,导致自噬相关因子活性上升,中枢胰岛素信号调控分子GSK3β表达上升。而经8周针刺干预后,电针组Atg1、Atg13、Beclin-1表达下降,GSK3β表达降低,IRI明显减轻,表明电针改善高脂高糖诱导的IR,可能与降低Atg1、Atg13、Beclin1活性,降低GSK3β的表达,改善中枢胰岛素信号传导有关。

综上所述,电针可通过下调自噬相关因子Atg1、Atg13、Beclin-1的表达抑制下丘脑细胞过度自噬,降低GSK3β的表达影响中枢胰岛素信号传导,进而发挥改善IR的作用。

参考文献:

[1]付晶晶,段君凯,李红.细胞自噬与凋亡的交互作用[J].生命的化学,2014,34(5):649-653.

[4]庄舒婷,李瑞,宋姗姗,等.电针对糖尿病肥胖大鼠下丘脑SOCS3､IRS-1蛋白表达及胰岛形态的影响[J].中国针灸,2022,42(9):1024-1028.

[6]李楚婷,赵天娇,黄琼.从自噬在胰岛β细胞中的作用探讨糖尿病治疗的药物靶点[J].中国临床药理学与治疗学,2020,25(3):344-351.

[7]张哲,王杏,杨林泉,等.利拉鲁肽通过调控AMPK/mTOR自噬信号减轻糖尿病大鼠心肌炎症和氧化应激损伤[J].中国药理学通报,2022,38(9):1308-1314.

[8]陈霞,岳枫,靳冉,等.高脂饲料诱导不同品系大鼠胰岛素抵抗模型的比较研究[J].山西中医学院学报,2013,14(4):9-12.

[9]李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2003:25.

[10]田佳星,李敏,仝小林.过食肥甘与糖尿病关系的历史沿革[J].中医杂志,2018,59(12):1002-1005,1010.

[11]余辕耕.电针通过调控肝脏SIRT1/ATG7改善胰岛素抵抗的机制研究[D].武汉:湖北中医药大学,2021.

[12]刘新燕,赵慧玲.针灸干预代谢综合征的研究概况[J].中国针灸,2015,35(S1):129-131.

[13]王静芝,张晓明,柳梅华,等.电针对胰岛素抵抗大鼠认知功能与下丘脑PI3K､Akt2蛋白表达的影响[J].辽宁中医杂志,2019,46(1):164-168.

[14]宋爱群,张阳普,姚敏,等.“标本配穴”电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠脑肠肽胆囊收缩素中枢敏感性的影响[J].中国针灸,2020,40(9):969-975.

[15]李云隆,赵振群,刘万林.激素性股骨头缺血坏死中PI3K/Akt/mTOR信号通路对自噬的调控[J].中国组织工程研究,2019,23(12):1921-1929.

基金资助:国家自然科学基金项目(81904276);湖北省卫生健康委员会中医药科研项目青年基金项目(ZY2021Q008);针灸治未病湖北省协同创新项目(HBPCIC-2020-08);国家中医药管理局岐黄工程项目[国中医药人教函(2018)284号];

文章来源:杨鸿静,张萌,吴松,等.电针对胰岛素抵抗大鼠下丘脑自噬活性的影响[J].上海针灸杂志,2024,43(04):456-463.