脑血管疾病是当今危害人类健康的三大疾病之一，是我国常见的一种慢性病，常遗留不同程度的神经功能障碍，严重影响人们的生活质量[1,2]。其中，缺血性脑血管疾病占脑血管疾病的40%～60%，超过半数患者会不同程度出现肢体偏瘫，丧失劳动力，给家庭和社会带来严重负担[3,4]。因此，研究如何防治脑梗死具有重要临床意义。中医针灸等非药物疗法已广泛应用于脑血管疾病的康复治疗中[5,6]，是临床有效的治疗手段，但具体作用机制尚未十分明确。

当今大量研究认为，炎症反应不仅在缺血性脑血管疾病的早期可加重脑损伤，同时在后期又起到修复组织和再生的功能，参与整个疾病的病理过程，发挥“双刃剑”的作用[7]。炎性小体作为炎症反应的核心部分，与细胞焦亡关系密切，在脑梗死发病中起着重要的作用，近年来备受关注[8]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎性小体是脑缺血研究最多的炎性小体，研究表明NLRP3炎性小体可能对介导炎症反应和诱导脑卒中后细胞损伤和死亡起到至关重要的作用，NLRP3炎性小体的活化可以通过诱发缺血性脑卒中的炎症联级反应，从而进一步加重脑损伤，是介导神经元损伤的重要环节[9]。因此，抑制NLRP3炎性小体活化是治疗缺血性脑卒中的重要干预靶点。本课题团队大量临床及基础研究表明，电针、头针等非药物手段可以有效改善缺血性脑损伤的神经功能症状[10,11,12]，故通过电针抑制脑缺血中的炎症反应以减轻脑组织损伤，可能成为脑血管疾病治疗的有效途径。综上，本课题拟从NLRP3炎性小体途径为切入点，探讨电针改善缺血性脑卒中神经缺损症状的可能作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

选用SPF级健康雄性SD大鼠36只，体质量为(250±50)g，饲养于福建中医药大学动物实验室[动物饲养环境许可证：SYXK(闽)2019-0007]，恒温恒湿，在12 h的光/暗循环条件下予以自由饮食与饮水。本研究经福建中医药大学医学伦理委员会审定(伦理批准文号：FJTCMIACUC)，动物使用许可证：SCXK(闽)2022-0003。所有大鼠处理依据科技部国科发财字〔2006〕398号《关于善待实验动物的指导性意见》、国家科学技术委员会令第2号《实验动物管理条例》及卫生部令第55号《医学实验动物管理实施细则》的要求实行。

1.2 主要材料及仪器

NLRP3、Caspase-1、ASC、β-actin抗体购自Proteintech公司；逆转录试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，总RNA提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司，QPCR试剂盒购自Singabio公司，IL-1β和IL-18试剂盒、TUNEL试剂盒、增强型RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂、5×Protein Buffer、彩色预染中分子量蛋白质标准、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western一抗及二抗稀释液、Tris-GlycineSDS电泳缓冲液、PVDF膜、TBS-T漂洗缓冲液等购于博士德生物有限公司；三甲基腺嘌呤(3-MA)购自美国Sigma公司。

超净工作台购自力康生物医疗公司，病理切片机(RM2016)购自上海徕卡仪器；Gel DOC2000凝胶成像系统、电热恒温水槽(DK-8AD)购于上海一恒有限公司；水平电泳槽、转移槽、凝胶玻璃板等均购自美国BioRad公司，冷冻离心机购于广州吉迪仪器有限公司，超净工作台QPCR仪购于北京鲲鹏基因科技有限公司，SpectraMax吸光度阅读器购自美谷分子仪器(上海)有限公司；HE成像仪(Nikon DS-U3)购于日本尼康，梯度PCR仪及超微量紫外可见分光光度计购于杭州米欧仪器有限公司，华佗牌电针仪购于苏州医疗用品厂有限公司等。

1.3 脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型的建立及分组

采用Longa等[13]改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。术前所有大鼠禁食12 h，不禁饮。按1 m L/100 g的剂量将3.5%水合氯醛通过腹腔注射麻醉大鼠，在颈部正中纵行切开，充分暴露血管，依次分离右侧颈总、颈外和颈内动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉远心端及颈内动脉，在颈总动脉剪一小口，推入一头端圆钝、直径约0.25 mm的尼龙丝至线栓有明显阻力停止，固定线栓，堵塞大脑中动脉起点。栓塞90 min后拔出线栓，固定好尼龙丝并缝合皮肤，最后消毒后放置37℃恒温台保温待醒。剔除手术过程意外及麻醉死亡的大鼠，每只大鼠于术后2 h采用Zea Longa评分法[13]进行神经功能评分，1～3分的大鼠纳入本次实验，0分和4分予以剔除，最后再将这些造模成功的大鼠随机分为模型组和电针组以备实验。假手术组只分离、暴露血管后缝合皮肤。研究中途凡因各种原因导致各组有出现死亡脱落，均按照随机抽样原则补齐实验动物。

1.4各组干预方法

电针组大鼠于造模后24 h行针刺，选取大鼠左侧“曲池”，位于桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中，“足三里”穴，位于膝关节下外侧，腓骨小头下3 mm处，选用0.5寸华佗牌毫针，直刺3 mm左右，接电针仪(电针型号：G6805)，以1/20 Hz、2 m A的强度持续30 min，每天同一时间治疗1次，连续14 d。模型组及假手术组术后不予任何治疗，回笼饲养，但可以在笼内饮水、进食、自由活动。

1.5 神经功能评分

所有大鼠分别于造模2h成功后及治疗7 d后行神经行为学评分，采用Zea Longa评分法[13]评估各组大鼠神经症状，具体评分方法：无任何神经损伤症状为0分；不能完全伸展对侧前爪为1分；向同侧转圈为2分；向对侧倾倒为3分；完全不能行走甚至意识丧失为4分。

1.6标本采集

各组大鼠在干预7 d后取材，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血5 m L，室温静置1 h后，置于离心半径约15 cm的离心机以3 500 r/min离心10 min，取上清液置于-80℃的冰箱备用行ELISA检测。

采血完成后，每组随机选取6只大鼠，用0.9%生理盐水从左心室行心脏灌注，将取下的脑组织放置4%多聚甲醛溶液中固定，进一步包埋制成石蜡标本，用于HE检测；剩余6只大鼠则迅速取新鲜脑组织置于-80℃冰箱中保存，用于后续实验检测。

1.6.1 HE染色

选取各组大鼠脑组织缺血皮质区经石蜡包埋后，进行连续切片，苏木红染色、封片等，镜子反射光下分别观察各组大鼠大脑皮质区病理学变化。

1.6.2 实时荧光定量PCR(QPCR)法检测NLRP3、ASC、Caspase-1表达

每组大鼠称取100μg的大鼠缺血区脑皮质组织，置于含有磁珠的2 mL研磨管中，加入1 mL的TRIpure裂解液进行粉碎。转移裂解液，剧烈震荡，静置，12 000 r/min离心15 min，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度及定量。取4μL的RNA样本和2μL的1×Loading buffer进行混合上样。根据引物设计的原则，由上海博尚生物工程技术有限公司进行合成，以相应种属的GAPDH作为内参基因，用Primer Premier 5.0设计目标和内参基因的特异性引物。引物序列如下。

取2μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA，根据以上引物进行QPCR的扩增检测各mRNA表达水平。

1.6.3 免疫印迹检测(Western blot法)对NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达影响

取各组大鼠左侧脑组织皮质区50μg，加入1 mL RIPA裂解液充分匀浆、离心，分离上清即为全蛋白提取物。采用BCA法进行蛋白浓度测定。15%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、洗涤，稀释一抗，分别加入NLRP3 1∶2 000、ASC 1∶2 000、Caspase-1 1∶2 000、GAPDH 1∶2 000，孵育过夜；次日TBST洗涤，加入二抗1∶5 000,37℃孵育，TBST清洗3次，DAB显色液显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，计算各组目的条带灰度值。灰度值比值大代表相应蛋白的表达量高。

1.6.4 ELISA检测血清IL-1β和IL-18表达

各组大鼠腹主动脉采血后，室温静置，经离心后分离血清，根据试剂盒说明书检测血清IL-1β、IL-18表达，依据标准孔数据绘制标准曲线并计算各样本含量。

1.7统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间或组内比较用单因素方差分析，组间两两比较方差不齐的情况用Dunnett's T3检验，方差齐用LSD检验。P<0.05或P<0.01均表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠神经行为学评分比较

造模成功后，模型组与电针组较假手术组Longa评分显著升高，差异有高度统计学意义(P<0.01)，但模型组与电针组组间对比差异无统计学意义(P>0.05)；经电针治疗7 d后，电针组Longa评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较(±s)  

2.2 各组大鼠脑皮质区病理形态变化

假手术组神经元细胞整齐且均匀对称地分布排列，神经元细胞的胞体呈圆形或多形性，胞质饱满丰富，可见清晰圆形核仁；模型组可见大量炎性细胞，表现为神经细胞周围间隙增宽，神经细胞排列不规则，结构不清，胞体缩小变形，胞质嗜伊红或浓染，细胞核固缩；较假手术组相比，电针组所见神经细胞核皱缩变形明显减少，见图1。

2.3各组大鼠脑皮质区NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达情况

造模成功后，与假手术组比较，模型组NLRP3、ASC、Caspase-1的m RNA表达升高，差异有高度统计学意义(P<0.01)；电针组的NLRP3、ASC、Caspase-1的m RNA表达与模型组差异有统计学意义(P<0.05)，电针组表达明显降低，见图2。

图1 各组大鼠脑皮质区HE染色结果(20×)   

2.4 各组大鼠脑皮质区NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达情况

模型组与假手术组比较，大鼠脑皮质区的NLRP3炎性小体相关蛋白即NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达明显升高(P<0.01)；经治疗后较模型组相比，电针组大鼠皮质组织NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 各组大鼠脑皮质区NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达比较(n=6)  

图3 各组大鼠脑皮质区NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达比较(n=6)   

2.5 各组大鼠血清IL-1β和IL-18的表达水平

大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-18含量模型组较假手术组比较显著增加(P<0.01)；相比模型组，电针组大鼠血清IL-1β、IL-18含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 各组大鼠血清IL-1β和IL-18含量比较(n=6)  

3、讨论

脑缺血再灌注损伤是脑缺血再灌注期的继发性损伤，是缺血性脑血管疾病引起脑组织损伤的重要过程。在这一过程中，会产生大量白细胞，其可通过激活相关炎症信号转导通路，释放大量炎症细胞因子，激活炎症反应，进一步诱导细胞焦亡而加重脑组织损伤，现代多数学者认为各类炎性小体介导了这一重要过程，可减轻再灌注所致二次损伤[14,15]。NLRP3炎性小体是目前最经典且研究广泛的一类炎性小体，大量研究发现，NLRP3炎性小体的活化若能得到有效抑制，可明显缓解脑组织损伤，减少神经细胞凋亡，改善神经缺损症状[16]。这些结果提示，通过调控NLRP3炎性小体介导的信号转导通路减少炎症反应可能是调控缺血性脑卒中的重要干预靶点。前期研究表明[17,18]，电针曲池、足三里可通过介导线粒体自噬、抑制细胞凋亡等通路，发挥对缺血性脑卒中的神经保护作用，促进神经功能的恢复。但其作用机制复杂，故本研究从NLRP3炎性小体途径入手，再次证实电针不仅能改善MCAO大鼠神经功能缺失症状，还能通过抑制NLRP3炎性小体活性改善大鼠脑缺血再灌注后炎症反应的作用。

传统中医学认为，中风乃于机体阴阳失调，脑中血海失养，气血逆乱，脉络瘀阻，或血溢脉外，损伤脑之元神而发病，可有猝然昏扑，半身不遂等表现。《灵枢·刺节真邪篇》“虚邪偏客于身半，其入深内居荣卫，荣卫稍衰则真气去邪气独留发为偏枯”，说明中风的发病与手足三阳闭阻有密切关系，治疗上应注重调和气血，通调经脉。故本实验根据《素问·痿论》“治痿独取阳明”理论，选取手阳明经之“曲池”和足阳明经之“足三里”穴进行干预，“曲池”是手阳明大肠经之合穴，“足三里”是足阳明胃经之合穴，两穴合用具有调和经络气血，舒筋通络的作用，是治疗中风病的常用穴位以及有效穴位，可更好地改善缺血性中风导致的神经功能缺损症状，这在前期的大量实验研究中已得到证实[19,20]。

研究表明，NLRP3炎性小体是目前诱发脑卒中细胞焦亡的核心因素之一，其通过NLRP3/ASC信号转导通路介导的炎性反应，不仅参与了脑缺血再灌注损伤，并且通过产生大量促炎因子加重炎性细胞坏死，继而加重继发性脑损伤，是神经元损伤的关键环节[21]。国内外大量动物试验研究表明，在脑卒中模型中，脑缺血后大脑皮质区细胞焦亡相关蛋白表达显著升高，NLRP3炎性小体相关产物如NLRP3、ASC等含量增加，并进一步诱导其下游关键产物pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1以及前炎症细胞因子等生成增加，提示脑缺血后NLRP3炎性小体通过活化Caspase-1与下游细胞因子共同作用，触发神经元的级联反应[22,23]，介导经典焦亡途径的激活。随着细胞焦亡相关蛋白表达显著增加，机体主要的炎症趋化因子IL-18及IL-1β在炎症过程中起重要作用，参与了中性粒细胞和内皮细胞黏附过程的调节，导致下游促炎因子分泌增多，由细胞内大量释放至胞外，诱导细胞程序性死亡，致使炎症反应进一步加剧[24]。这些研究均表明NLRP3在脑缺血中起了重要作用，介导了脑卒中的损伤。因此，抑制NLRP3炎性小体的活化可减轻脑缺血再灌注损伤。那么，在本研究结果中，我们同样发现脑缺血再灌注损伤后神经细胞周围间隙增宽，神经细胞排列不规则，结构不清，胞体缩小变形，说明脑缺血后有大量的炎性细胞产生，而且NLRP3炎性小体组成的NLRP3、ASC蛋白及mRNA表达均同步增加，其活化后的下游产物Caspase-1、IL-1β及IL-18表达均增高，经电针治疗7 d后，神经细胞核皱缩变形明显减少，NLRP3、ASC蛋白及mRNA表达减少，同时，其通路上的Caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平均明显降低，这表明电针可以抑制NLRP3炎性小体的活化减轻脑缺血再灌注损伤，从而减轻大鼠神经功能缺失症状，发挥对脑缺血再灌注的神经保护作用。

综上所述，电针MCAO大鼠“曲池”“足三里”可能与抑制NLRP3炎性小体的活化及下游相关通路表达密切相关，可通过该途径改善神经功能缺损症状，减轻脑组织炎症反应，起到一定的神经保护作用。电针对机体的调控是多方面的，现有研究只针对单一途径中的某一靶点，电针能否通过其他途径调控NLRP3炎性小体相关通路产生神经保护作用，以及各个通路途径的对话尚未进行进一步研究，未来可以从多途径多靶点深入探讨电针治疗脑卒中的作用机制。

参考文献:

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[18]陈阿贞,兰岚,谢小文,等.电针通过Parkin介导的线粒体自噬途径改善脑缺血再灌注损伤的机制研究[J].江西中医药大学学报,2023,35(6):98-102.

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基金资助:福建省科技厅自然科学基金项目(2020J01759);福建省中医药科研项目计划(2021zyjc20);福建省卫健委青年科研课题(2020QNA065);

文章来源:陈阿贞,兰岚,谢小文,等.电针抑制NLRP3炎性小体活化改善缺血性脑卒中的机制研究[J].中国疗养医学,2024,33(05):1-6.