心血管疾病仍然是全球人群死亡率增加的主要原因，动脉粥样硬化是心血管疾病的关键环节。由于中草药经济、安全的特点，中草药治疗是现代医学体系中，对包括心血管疾病在内多种疾病的替代及补充治疗方法。银杏叶提取物(GBE)作为一种植物药，其药用价值一直受到关注。GBE制剂如“天保宁”“金纳多”广泛应用于临床。GBE主要活性成分包括萜类化合物及黄酮类化合物(主要是槲皮素、山柰酚和异鼠李素)[1]。标准GBE,EGb761,包含22%～24%银杏黄酮类化合物，6%萜类化合物(3.1%银杏内酯A、B、C、J以及2.9%白果内酯)和< 0.005‰的银杏酸。GBE50是一种新型的类似于EGb761的GBE。GBE50中银杏总黄酮及萜类化合物的含量分别超过44%及6%。GBE因其抗氧化、减轻炎症反应、抑制血小板活化、调节血糖及血脂的作用在治疗动脉粥样硬化领域显示出独特的优势。本文对GBE治疗动脉粥样硬化的机制及临床应用作一综述。

1、GBE抗动脉粥样硬化机制

1.1 内皮保护机制

氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)、高血糖以及高血压诱导的氧化应激/血管炎症，是内皮损伤及动脉粥样硬化形成的始动环节，并贯穿于动脉粥样硬化全过程。GBE通过抗氧化应激、抗炎、拮抗细胞死亡保护血管内皮，发挥抗动脉粥样硬化的重要作用。

1.1.1 抗氧化应激机制

在动脉粥样硬化过程中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶(NOXs)的表达及活性增强，导致活性氧产生过多，进而增加脂质过氧化水平，从而损伤血管内皮。载脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠动脉粥样硬化模型及一系列体外细胞模型显示出GBE在改善内皮细胞氧化应激方面具有优势[2]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是NOXs活性增加，以及活性氧过度产生的上游信号通路。通过调控p38MAPK通路减轻活性氧产生是GBE发挥抗氧化应激的机制之一[3-4]。核因子E2相关因子(Nrf2)是改善细胞氧化应激的关键分子，能对抗细胞活性氧产生带来的脂质过氧化及铁死亡。近年来，研究发现GBE通过上调Nrf2改善氧化应激的作用，是其发挥抗动脉粥样硬化的潜在分子机制[5]。Wang等[6]研究发现，GBE可能通过改善人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的脂质代谢，下调经Ox-LDL诱导的HUVECs中NOX-4的表达，同时减少线粒体活性氧的生成。

1.1.2 抗炎症机制

在动脉粥样硬化发生发展过程中，Ox-LDL作用于血管内皮细胞，降低5′-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)介导的蛋白激酶B (Akt)信号转导通路的活化，进而激活内皮细胞核因子κB(NF-κB)介导的炎症反应，产生一系列黏附分子，包括细胞黏附分子1(ICAM-1)以及血管细胞黏附分子1(VCAM-1),通过增加单核细胞对内皮细胞的黏附损伤血管内皮。50 μg/ml GBE预处理人主动脉内皮细胞(HAECs)通过下调NF-κB降低VCAM-1表达，抑制人类单核细胞系U937和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的HAECs间的黏附[7]。因此，GBE可以通过上调AMPK/Akt级联反应，抑制Ox-LDL对NF-κB的活化，以及单核细胞对内皮细胞黏附。在经典的AMPK/Akt/NF-κB路之外，Nrf2/血红素加氧酶1(HO-1)信号转导通路在调控血管炎症方面具有重要作用。GBE通过调控Nrf2/HO-1表达，降低VCAM-1表达以及炎症细胞对内皮的黏附[5]。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)与循环中LDL升高相关，Ox-LDL上调HUVECs中PCSK9表达，从而干扰HUVECs脂质代谢，而银杏内酯B处理会抑制固醇结合蛋白的表达，显著下调PCSK9的mRNA和蛋白水平，并且干扰了PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDL-R)的相互作用，进一步增加Ox-LDL诱导的LDL-R表达。此外，银杏内酯B下调Ox-LDL诱导HUVECs表达凝集素样Ox-LDL受体1的表达，显著抑制ICAM-1/VCAM-1表达；并且在mRNA和蛋白水平上抑制白细胞介素1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、C-X-C模体趋化因子配体1(CXCL-1)、CXCL-2和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达，从而明显改善Ox-LDL激活的HUVECs的炎症反应和脂质代谢的改变[6]。

高血糖通过激动NF-κB促进内皮细胞IL-6分泌，进而增加信号转导和转录激活因子3的活性，从而促进ICAM-1的表达[8-9]。GBE及银杏内酯A通过抑制IL-6的释放，下调ICAM-1,进而减少单核细胞对HAECs的黏附[8-9]。

1.1.3 拮抗内皮细胞死亡及促进内皮修复机制

由于活性氧的产生促进线粒体损伤及线粒体释放到细胞质中，进而通过环状腺苷酸-鸟苷酸合酶途径促进STING激活，STING可以激动下游NF-κB,进而参与血管慢性炎症过程。此外，STING可以通过激动下游NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3),增加炎症小体形成，促进NLRP3介导的细胞焦亡途径激活。细胞焦亡是与炎症相关的细胞死亡途径，因此推测，GBE可以通过减少活性氧产生，减少线粒体DNA释放入细胞质，进而抑制STING/NF-κB通路介导的慢性炎症，以及STING/NLRP3介导的内皮细胞焦亡。

细胞自噬可以通过调控分解代谢清除受损或有害成分，维持营养和能量的动态平衡。适度的细胞自噬作为一种重要的保护机制，可使细胞在多种病理刺激下(营养物质/生长因子剥夺、缺氧、活性氧、DNA损伤)存活。细胞自噬与内质网应激存在交互效应，适度的细胞自噬减轻内质网应激。AMPK-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是调控巨噬细胞自噬的经典通路。前期体内研究发现[10],GBE可以调控mTOR,上调链脲佐菌素(STZ)诱导的ApoE-/-小鼠主动脉自噬水平，减轻内质网应激，延缓动脉粥样硬化进展。在STZ诱导的糖尿病心肌损伤模型上，同样证实了GBE可能通过调控AMPK-mTOR通路，上调细胞自噬，减轻心肌损伤。因此，推测GBE可能通过调控AMPK-mTOR通路，上调适度的自噬，减轻炎症、氧化应激诱导的内皮细胞死亡[11]。具体有待进一步研究证实。

Wu等[12]研究证实了GBE可以促进体内骨髓来源内皮祖细胞的迁移，加速小鼠损伤股动脉内皮修复；体外研究也进一步证实GBE通过激动磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS),进而上调HO-1表达促进人早期及晚期内皮祖细胞迁移。综上，GBE一方面直接抑制血管内皮细胞损伤，另一方面增强血管内皮细胞的修复。

1.2 抑制巨噬细胞炎症及泡沫细胞形成

在动脉粥样硬化形成早期，血液中单核细胞通过内皮间隙，在内膜下分化为巨噬细胞；巨噬细胞或者血管平滑肌细胞对Ox-LDL的过度摄取形成泡沫细胞。巨噬细胞胆固醇外流受损在泡沫细胞堆积在动脉粥样硬化进展中发挥了十分重要的作用。在动脉粥样硬化过程中A类清道夫受体(ABCA1、ABCG1)介导泡沫细胞胆固醇外流[13]。Tsai等[14]发现，25、50、100 μg/ml EGb761通过HO-1依赖的SR-A下调以及ABCA1的上调，剂量依赖性地减轻Ox-LDL介导的脂质沉积。并且在体研究证实了EGb761上调ApoE-/-小鼠主动脉ABCA1蛋白，而降低SR-A表达[14]。类似的，Liu等[15]研究报道0.1 mg/L EGb761通过下调单核细胞Ox-LDL诱导的血管内皮生长因子，抑制单核/巨噬细胞来源的泡沫细胞形成，减轻动脉粥样硬化。适度的巨噬细胞自噬及选择性巨噬细胞清除，可以减少泡沫细胞形成。我们前期也提出，GBE可以通过调控mTOR通路调控巨噬细胞自噬，减轻斑块脂质沉积[10]。研究发现，一种来自于GBE的黄酮可以减少单核细胞对Ox-LDL的摄取及脂质沉积，同时降低了CD36及过氧化物酶体增殖激活受体γ的表达，增加ABCA1表达；反之，过表达CD36及过氧化物酶体增殖激活受体γ减弱了黄酮对单核细胞脂质沉积的抑制[16]。上述研究为GBE治疗动脉粥样硬化提供了依据。

1.3 抑制血管平滑肌细胞增殖/迁移

血管平滑肌细胞增殖和迁移在动脉粥样硬化进展中起关键作用。有研究报道GBE在体外剂量依赖性减轻大鼠主动脉平滑肌细胞增殖，在体研究中GBE减轻球囊剥脱高脂饲喂大鼠胸主动脉粥样硬化斑块[17]。此外，另一研究发现，100、200 mg/kg EGb761口服6周剂量依赖性地降低糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增殖。在体外，50～200 μg/ml EGb761剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖和迁移[18]。Wu等[12]体内研究也证实GBE减少平滑肌样前体细胞在小鼠股动脉损伤处的迁移，从而减少内膜增殖；体外研究发现GBE通过调控p38MAPK通路，抑制平滑肌样前体细胞迁移。上述研究为GBE减少经皮血管成形术后内膜增殖奠定了理论基础。

1.4 抑制血小板活化/聚集

血小板激活和聚集在动脉粥样硬化发生发展中具有重要作用。血小板活化因子(PAF)作为体内一种重要的磷脂类递质，主要由中性粒细胞、血小板、肥大细胞、内皮细胞和巨噬细胞产生，具有介导血小板聚集及炎症反应等多种生物学功能。活化的血小板α颗粒、致密颗粒释放到循环血液中进一步引发循环炎症反应。本课题组前期综述了银杏内酯B可以有效抑制PAF受体，并且可以竞争性抑制PAF介导的血小板活化[2]。0.6 mg/ml银杏内酯B可以通过调控PI3K/Akt信号转导通路以及p38MAPK磷酸化抑制凝血酶(0.5 U/ml)及胶原(10 μg/ml)诱导的人类血小板聚集，抑制率分别为43.2%、51.3%,部分抑制凝血酶(0.5 U/ml)-活化的血小板钙离子外流(52.7%)[2]。Ke等[19]在对血小板活化抑制的体外研究中发现，阿司匹林联合GBE对花生四烯酸、PAF、5′-二磷酸腺苷及胶原诱导的血小板活化具有协同抑制作用。富集分析表明，GBE50可通过调控环磷酸腺苷(cAMP)通路、花生四烯酸代谢和钙信号通路抑制血小板聚集；阿司匹林主要通过调控花生四烯酸代谢抑制血小板活化。酶联免疫吸附试验分析表明，GBE50与阿司匹林联合应用可提高静息血小板中cAMP水平，降低血栓素B2和PAF水平。Hsia等[20]研究发现，0.5～1 μmol/L的银杏双黄酮通过抑制磷脂酶Cγ2/蛋白激酶C、PI3K/Akt/糖原合成酶激酶3β和丝裂原活化蛋白激酶激活，进而抑制胶原及花生四烯酸诱导的血小板聚集。一项针对临床研究中植物药对血小板抑制的系统性综述中，也报道了GBE对血小板的抑制作用[21]。

1.5 调节血管收缩/舒张

在炎症、高糖、高血压等病理因素刺激下，血管内活性物质(一氧化氮、内皮素1)及细胞内Ca2+失衡，导致血管舒缩功能失调。GBE(10、50、100 μg/ml)预处理HUVECs, 通过促进eNOS的表达增加一氧化氮产生[22]。Wu等[23]发现GBE可以通过调控一氧化氮及内皮素1之间的平衡，增加冠心病(冠状动脉粥样硬化性心脏病)患者前降支血流。

1.6 对代谢的调节作用

1.6.1 调节脂质代谢

在一些高脂饲喂的模型中，GBE显示出降低胆固醇及甘油三酯的作用[14,24]。Wang等[25]通过油酸诱导HepG2细胞产生脂质，筛选出GBE中4种主要双黄酮类化合物。通过反向靶向和分子动力学模拟筛选出双黄酮类化合物对动脉粥样硬化潜在靶点的非共价作用，通过外源细胞模拟评估了双黄酮与潜在靶点之间的相互作用。在所有4种双黄酮类化合物中，银杏双黄酮显著抑制油酸诱导的HepG2细胞脂质生成，降低总胆固醇和甘油三酯水平。另外有研究发现口服GBE能有效缓解高胆固醇血症、全身炎症和动脉粥样硬化，这些作用与调节肠道微生物组分、保护肠道黏膜的完整性和改善微生物代谢表型有关[26]。

1.6.2 调节糖代谢

糖尿病是动脉粥样硬化的高危因素。GBE可以通过保护胰岛β细胞或刺激胰岛素分泌增加血浆胰岛素水平，并增加胰岛素敏感性，从而调控糖代谢，对代谢综合征具有积极的治疗作用[27]。GBE通过增加糖尿病大鼠过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及超氧化物歧化酶活性保护胰岛β细胞。100、200和300 mg/kg GBE口服30 d, 可以降低糖尿病大鼠血糖水平。其中，300 mg/kg GBE可以将血糖降低至正常水平[28]。另有研究表明EGb761(50 mg/ml)可以通过提高[Ca2+]i, 激动钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ及蛋白激酶A,显著刺激大鼠胰岛素瘤细胞系分泌胰岛素[29]。

GBE通过降低TNF-α,增加胰岛素受体底物1(IRS-1)、PI3K磷酸化以及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达，促进胰岛素诱导的胰岛素受体及Akt的磷酸化，增加胰岛素敏感性[2]。Li等[30]研究发现，GBE显著增强C2C12肌细胞GLUT4向质膜的转位，从而促进葡萄糖的摄取。同时，还增加了AMPK及下游靶标的磷酸化，以小干扰RNA敲除AMPK或者应用化合物C抑制AMPK磷酸化均可以逆转GBE的效应。此外，GBE通过提高胰岛素刺激的葡萄糖摄取、增加Akt磷酸化，以及恢复GLUT4从细胞质到细胞膜转位，改善棕榈酸诱导的胰岛素抵抗。这些效应均被AMPK磷酸化抑制剂-化合物C逆转。因此，GBE可以通过AMPK途径改善棕榈酸诱导的肌细胞胰岛素抵抗[30]。Li等[31]以高脂饲喂C57BL/6J小鼠连续15周，从第3周到第15周每天以25、50、100 mg/kg GBE50灌胃，结果显示GBE50可以激活IRS-1信号及Akt信号通路，增加胰岛素敏感性。我们前期研究也发现，GBE可以改善STZ诱导的糖尿病大鼠血糖水平[11]。

晚期糖基化终末产物(AGEs)是由还原糖的羧基和游离的氨基反应形成的复合物。AGEs与其受体结合，诱导炎症反应及氧化应激，一方面损伤血管内皮，另一方面，促进平滑肌细胞的表型转换以及血栓形成。上述作用共同促进了糖尿病状态下动脉粥样硬化。研究发现，GBE灌胃降低糖尿病大鼠血清晚期糖基化终末产物水平，改善其带来的血管损伤[2]。因此，GBE可以通过这一机制抑制抗氧化、减轻高血糖诱导的内皮黏附，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

1.7 对肠道微生物的调节作用

近年来研究发现，肠道微生物及其代谢失衡在动脉粥样硬化发病过程中发挥着重要作用。Lv等[32]研究发现，GBE可有效改善高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血脂异常、炎症、动脉粥样硬化斑块以及肠道屏障功能障碍。肠道微生物的调节，尤其是乳酸杆菌的增加以及螺杆菌的减少是GBE发挥抑制动脉粥样硬化作用的关键机制。Wang等[26]证实了GBE有效减轻LDL-R基因敲除小鼠高胆固醇血症、炎症和动脉粥样硬化。16S rRNA测序显示，GBE重塑了高脂干扰的诱导的肠道微生物群尤其降低了厚壁菌门/拟杆菌门，并提高了阿克曼菌属、异普雷沃氏菌属、另枝菌属、副拟杆菌属丰度。此外，GBE还降低肠道促炎细胞因子的转录水平，提高紧密连接蛋白的表达，从而发挥减轻肠道炎症和修复肠道屏障的作用。靶向代谢组学分析表明，GBE可以显著逆转微生物代谢表型的功能障碍，包括促进短链脂肪酸、吲哚-3-乙酸酯和次级胆汁酸的产生，而这些物质与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。总之，上述研究为GBE治疗动脉粥样硬化机制提供了新的依据。

2、GBE在改善动脉粥样硬化中的临床应用

既往研究报道了黄酮类化合物的摄入量与心血管疾病的发生率/死亡率成反比[33-34]。多项临床研究评价GBE的心血管保护作用，一项4期随机、双盲、安慰剂临床对照试验(NCT03483779)旨在评估GBE对血糖调节受损心脏病患者的临床疗效和安全性，招募12例患者进行为期58周的试验[35]。2018年发表的一项荟萃分析纳入41项研究，共计4 462例患者，结果显示GBE与传统西药联用，可以更有效地改善心绞痛，降低血浆黏度和纤维蛋白原水平[36]。后续2019年一项荟萃分析纳入73项随机对照研究(7 621例)患者，结果显示与传统西药对比，西药联合GBE治疗能更有效地改善心绞痛[37]。2022年发表的一项荟萃分析，纳入了17项研究共计1 104例患者，报道了与安慰剂对比，GBE能显著改善患者血清C反应蛋白、IL-6以及TNF-α水平[38]。近期，He等[39]通过一项多中心临床研究纳入了72例稳定型冠心病合并抑郁患者，结果显示，与安慰剂对比，银杏叶治疗3个月后心绞痛和抑郁明显改善。

3、药物安全性

按一般剂量口服GBE可能会引起轻微的不良反应，主要包括轻微的肠胃不适、头痛、头晕、便秘和皮肤过敏反应，而这些反应可以自发性消失[40-41]。

4、结论与展望

流行病学、临床前和临床研究表明，食用含有山柰酚的食物和药物与罹患心血管疾病的风险成反比[33],因此，GBE中单体成分药物的研发及有效靶点的筛选，将为动脉粥样硬化治疗提供新的依据；并且将GBE单体作为食物补充，有助于动脉粥样硬化的早期预防[34]。

尽管血运重建是目前治疗冠心病的重要手段，但是血运重建后非靶病变进展，以及靶血管支架内再狭窄仍是临床的难点问题。GBE通过多通道、多靶点改善动脉粥样硬化的作用，联合西药有望为治疗动脉粥样硬化提供安全、经济、有效的方法。

参考文献(41)

[1]徐振伟,刘晓蕾,李新毅.银杏叶提取物治疗血管性痴呆的作用机制研究进展[J].中国医药,2022,17(4):623-626.

基金资助:北京市卫生健康委员会高层次公共卫生技术人才建设项目(领军人才-02-01);北京市科协青年人才托举工程;北京市医院管理中心“登峰”人才培养计划(DFL20220603);北京市医院管理中心“青苗”计划(QML20210603)~~;

文章来源:田晋帆,罗涵中,刘立波,等.银杏叶提取物在抗动脉粥样硬化中的机制及临床应用进展[J].中国医药,2024,19(11):1732-1736.