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食源性胆碱对小鼠动脉粥样硬化的影响及作用机制

2024-11-25 112 上传者：管理员

摘要：目的探讨食源性胆碱对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响机制。方法将32只雄性ApoE-/-小鼠随机分成阴性对照组、食源性胆碱组、阳性对照组、抗生素组，每组各8只，阴性对照组给予正常饮食，食源性胆碱组给予食源性胆碱饮食，阳性对照组给予氧化三甲胺饮食，抗生素组在腹腔注射抗生素的基础上给予食源性胆碱饮食，饲喂12 w后，全自动生化分析仪检测血清中血脂含量，苏木素-伊红（HE）染色对小鼠主动脉进行染色，Western印迹法及免疫组化法检测主动脉壁清道夫受体CD36及A1类清道夫受体（SR-A1）的表达，Western印迹法检测肝脏黄素依赖性单加氧酶（FMO）3的表达情况。结果各组血脂水平差异无统计学意义（P>0.05）。与阴性对照组相比，阳性对照组和食源性胆碱组主动脉管壁显著增生，斑块形成明显，主动脉壁CD36、SR-A1和肝脏FMO3的表达显著增加（P<0.05）;与阳性对照组相比，食源性胆碱组同样发生了动脉粥样硬化的结局；与食源性胆碱组相比，抗生素组主动脉内膜完好，内皮细胞排列整齐，主动脉壁清道夫受体CD36、SR-A1和肝脏FMO3的表达显著下降（P<0.05）。结论食源性胆碱可通过增加小鼠肝脏FMO3的表达，进而上调主动脉巨噬细胞清道夫受体CD36、SR-A1水平，来促进动脉粥样硬化的发展，此过程与血脂水平的变化无关。

关键词：
动脉粥样硬化
清道夫受体;
血脂
食源性胆碱
黄素依赖性单加氧酶3
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动脉粥样硬化(AS)主要由脂肪浸润及血小板聚集和血栓形成引起，泡沫细胞的形成是AS初始阶段的标志，巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源，其上的清道夫受体包括CD36和A1类清道夫受体(SR-A1)介导氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)的摄取，促进胆固醇在巨噬细胞中的沉积，使巨噬细胞转化为泡沫细胞，促进AS的发生[1,2]。研究表明，血浆氧化三甲胺(TMAO)水平与心血管不良事件的风险呈正相关[3],TMAO已被确定为促进AS的新型且独立的危险因素。食源性胆碱是TMAO的前体，可在肠道微生物的作用下产生三甲胺(TMA),随后被宿主吸收，通过门脉循环经肝脏黄素依赖性单加氧酶(FMO)3进一步加工成TMAO[4,5]。近年来，TMAO与AS病变的关系成为研究热点[6],但食源性胆碱对实验性小鼠AS的影响尚不十分清楚。本研究探讨食源性胆碱饲喂小鼠主动脉巨噬细胞清道夫受体CD36和SR-A1的表达及血脂水平的改变，探讨食源性胆碱对AS的影响及分子机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

32只7～8周龄健康雄性SPF级载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠，体质量18～20 g,购自南京集萃药康公司，饲养于安徽医科大学实验动物中心SPF级动物房内，动物照明时间7∶00～19∶00,昼夜交替12 h/12 h,室温22～24℃,相对湿度50%,自由采食摄水。

1.2主要试剂及仪器

胆碱(批号：C12682435)、TMAO(批号：C12725550)、万古霉素(批号：21B0901)、硫酸新霉素(批号：BL200309)、甲硝唑(批号：TE310934)、氨苄青霉素(批号：JR006234)购自上海Macklin公司；FMO3抗体(批号：ab126790)、CD36抗体(批号：ab52629)、SR-A1抗体(批号：ab151707)购自英国Abcam公司；GAPDH抗体(批号：ABL1020)购自美国Abbkine公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒(批号：SK6010-250T)购自北京Coolaber公司；链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(批号：BL730A)、枸橼酸缓冲液(批号：BL604A)购自合肥Biosharp生物公司。日立3100全自动生化分析仪(日本Hitachi公司),YB-7B组织包埋机、徕卡RM2135型石蜡切片机、徕卡DM6B正置荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.3动物分组及给药

32只ApoE-/-小鼠适应性喂养1 w后，按照随机数字表法分为4组各8只，阴性对照组使用普通饲料(配方成分：玉米、小麦、豆粕、麸皮、鱼粉、各种氨基酸和复合维生素等)喂养；食源性胆碱组使用普通饲料+胆碱(10 g/L)加入饮用水中喂养；阳性对照组使用普通饲料+TMAO(3 g/L)加入饮用水中喂养；抗生素组使用普通饲料+腹腔注射广谱抗生素[万古霉素100 mg/(kg·d),新霉素200 mg/(kg·d),甲硝唑200 mg/(kg·d),氨苄西林200 mg/(kg·d)] +胆碱(10 g/L)加入饮用水中喂养，各组饮用水隔天换1次，干预12 w后，禁食12 h后处死小鼠，取外周血，解剖肝脏组织并冻存，解剖显微镜下分离胸主动脉，部分用多聚甲醛固定，部分冻存待测。

1.4小鼠血清脂质测定

小鼠经戊巴比妥麻醉后行眼眶采血，3 000 r/min离心后取得血清，采用日立3100全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.5苏木素-伊红(HE)染色

观察小鼠主动脉的病理学改变胸主动脉固定后，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，随后行石蜡切片，切片厚度5μm左右，然后依次进行脱蜡、染色、脱水、透明、封片后置于光镜下观察并摄片。

1.6免疫组化(IHC)法检测

CD36、SR-A1在血管的沉积将胸主动脉的石蜡切片放于65℃恒温箱中烘烤2 h,依次经过脱蜡、水化后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温10 min消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗后使用柠檬酸盐修复液95℃修复，然后进行血清封闭，随后滴加一抗，4℃孵育过夜，次日滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，各步骤间使用磷酸盐缓冲液(PBS)4 min×5次充分洗涤，苏木素复染5 min,脱水、透明、封片，光镜下观察并摄片，采用ImageJ软件对免疫组化结果进行分析，测定其平均光密度值(累积光密度/测量区域面积)。

1.7 Western印迹法检测CD36、SR-A1及FMO3蛋白表达

将冻存的肝脏、胸主动脉血管分别用裂解液提取总蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒操作测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶对蛋白样本进行电泳，先浓缩胶电压40～70 V,Marker跑开后换分离胶电压100～200 V,Marker跑散时结束电泳，取出凝胶转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，电流200 mA,冰中转膜3.5 h,转膜结束后可水洗2～3 min,随后5%脱脂牛奶室温摇床上封闭2 h,结束后使用超纯水冲洗2～3遍，剪开目标条带，4℃一抗孵育过夜，第2天用TBST缓冲液洗涤后再用二抗室温孵育2 h,电化学发光(ECL)液曝光，使用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.8统计学方法

采用Graphpad Prism9.0进行数据分析，计量资料服从正态分布以表示，符合方差齐性检验，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

2、结果

2.1各组血浆内TG、TC、LDL、HDL含量

4组血浆TG、TC、LDL、HDL含量差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组血浆内TG、TC、LDL、HDL含量比较

2.2各组胸主动脉组织病理变化

与阴性对照组相比，食源性胆碱组和阳性对照组动脉内膜增生，内皮细胞排列紊乱，斑块形成明显，可见大量炎性及泡沫细胞浸润；与食源性胆碱组相比，抗生素组动脉内膜完好，内皮细胞排列整齐，染色均匀。见图1。

图1各组动脉壁病理(HE染色，×400)

2.3各组主动脉巨噬细胞CD36、SR-A1在血管壁的沉积

免疫组化染色CD36、SR-A1阳性呈明显棕黄色染色，表现为胞膜胞质染色。与阴性对照组相比，食源性胆碱组和阳性对照组中CD36、SR-A1可见明显棕黄色染色；与食源性胆碱组相比，抗生素组中CD36、SR-A1未见明显棕黄色染色。见图2。与阴性对照组相比，食源性胆碱组和阳性对照组CD36、SR-A1平均光密度值显著增加(P<0.05);与阳性对照组相比，食源性胆碱组中清道夫受体上述指标无显著差异(P>0.05);与食源性胆碱组相比，抗生素组中清道夫受体上述指标显著降低(P<0.05)。见表2。

2.4各组胸主动脉CD36、SR-A1蛋白表达

与阴性对照组相比，食源性胆碱组和阳性对照组胸主动脉内CD36、SR-A1蛋白表达明显增加(P<0.05);与阳性对照组相比，食源性胆碱组胸主动脉内上述指标无显著差异(P>0.05);与食源性胆碱组相比，抗生素组上述指标显著下降(P<0.01)。见表2、图3。

2.5各组肝脏内FMO3蛋白水平表达

与阴性对照组相比，食源性胆碱组和阳性对照组肝脏内FMO3表达显著增加(P<0.01);与阳性对照组相比，食源性胆碱组FMO3表达无显著差异(P>0.05);与食源性胆碱组相比，抗生素组FMO3表达显著下降(P<0.01)。见表2、图3。

图2各组胸主动脉CD36、SR-A1在血管壁沉积(IHC染色，×400)

表2各组胸主动脉清道夫受体CD36、SR-A1平均光密度值、巨噬细胞CD36、SR-A1及肝脏FMO3蛋白相对表达量

图3各组巨噬细胞CD36、SR-A1蛋白及肝脏FMO3蛋白表达

3、讨论

越来越多的研究致力于寻找治疗AS的新靶点，近年来，随着对TMAO研究的深入，发现其可促进AS的发生发展[7～9],肠道菌群在TMAO诱导的AS的病理生理中发挥了关键作用[10]。胆碱是人体必需的营养素，是卵磷脂和鞘磷脂的重要组成成分，广泛存在于动物性和植物性食品中，鸡蛋、牛肉、鱼及一些十字花科蔬菜等都含有丰富的胆碱，食源性胆碱是体内TMAO的主要来源，TMAO水平随着食源性胆碱摄入量的增加而升高[11],在肠道微生物的作用下，食源性胆碱通过肠道微生物所含的TMA裂解酶转化成TMA,随后通过肝脏FMO3进一步加工成TMAO。FMOs家族在人类基因组中以FMO1-5和FMO6P的形式存在，在TMA向TMAO转化中，FMO3效率最高，若肝脏FMO3基因发生突变，TMA转化为TMAO的过程不能正常进行，体内过多的TMA由尿液、汗液等排出体外，散发出鱼腥臭味，称为“鱼腥味综合征”[12,13]。研究人员发现，在使用TMAO诱导的巨噬细胞中，若使用丝裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(MAPK/JNK)途径抑制剂，则会阻碍巨噬细胞CD36的表达[14],有研究通过对体外巨噬细胞的研究，发现TMAO可增加巨噬细胞清道夫受体CD36、SR-A1介导的胆固醇摄取，在体外发挥致AS的作用[15]。

本实验结果显示，喂食食源性胆碱的小鼠，经过正常的肠道微生物作用后，肝脏FMO3表达明显增加，进一步促进食源性胆碱的代谢，上调主动脉清道夫受体CD36和SR-A1的表达，使得巨噬细胞不断摄取ox-LDL,导致巨噬细胞内脂质蓄积，为泡沫细胞的形成提供条件，最终促进AS的发生。食源性胆碱代谢依赖于肠道微生物，若用广谱抗生素抑制肠道微生物群，则阻碍了食源性胆碱向TMA的转化，肝脏FMO3的表达下降，下调CD36和SR-A1的表达，可能阻断食源性胆碱诱导的AS的发生。研究表明，TMAO的促AS作用与血脂无关[16,17],本实验发现，补充食源性胆碱或抗生素并没有对小鼠血脂水平产生影响，这表明食源性胆碱在体内代谢后，通过增加受体水平而非增加脂蛋白水平来促进AS的发生。

综上所述，在肠道微生物的作用下，食源性胆碱可在代谢过程中上调主动脉清道夫受体CD36、SR-A1的表达，在不影响血脂水平的情况下促进AS发展，广谱抗生素则可阻断胆碱诱导的AS发生。这提示高食源性胆碱饮食可能促进AS发生发展，应在今后的研究中进一步探讨。

参考文献:

6刘赫,张梦轩,蒋本春,等.氧化三甲胺在动脉粥样硬化性缺血性脑卒中的研究进展[J].中国老年学杂志,2021;41(14):3137-41.

9王安璐,李秋忆,徐浩,等.肠道菌群与动脉粥样硬化的关系[J].中国动脉硬化杂志,2020;28(2):93-8.

10李天翔,李素娟,郝祥宇,等.肠道菌群及代谢与载脂蛋白E在动脉粥样硬化中的相互作用[J].中国微生态学杂志,2020;32(9):993-7.

基金资助:安徽省人社厅安徽省学术和技术带头人学术科研项目(2021D279);安徽高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2018A0708);

文章来源:闫丽萍,王庆航,夏阳,等.食源性胆碱对小鼠动脉粥样硬化的影响及作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5564-5568.