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MicroRNA在动脉粥样硬化临床诊断中的作用

2021-03-01 130 上传者：管理员

摘要：目的:探讨MicroRNA在动脉粥样硬化临床诊断中的作用。方法:选择本院120名冠状动脉粥样硬化的患者(冠脉粥样硬化组),另选择45名健康者为健康对照组,检测两组血脂,血清白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平以及microRNA-155、microRNA-143、microRNA-145的表达,并分析冠脉粥样硬化患者上述microRNA表达与血脂、炎症因子水平间的相关性。结果:与健康对照组比较,冠脉粥样硬化组血清microRNA-155表达显著升高,microRNA-143,microRNA-145表达显著降低(P均=0.001);且冠状动脉粥样硬化患者中microRNA-155表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平均呈显著正相关(r=0.627～0.737,P均=0.001),与HDL-C水平呈显著负相关(r=-0.668,P=0.001);microRNA-143(r=-0.593～-0.458)和microRNA-145(r=-0.783～-0.311)表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平呈显著负相关(P均=0.001),与HDL-C水平均呈显著正相关(r=0.572、0.824,P均=0.001)。结论:脂质代谢及血管炎症反应参与了动脉粥样硬化的进展,microRNA-155、microRNA-143、microRNA-145与之密切相关,且对动脉粥样硬化的临床诊断具有重要的意义。

关键词：
中层平滑肌细胞
冠状动脉疾病
动脉粥样硬化
微RNAs
慢性炎症性疾病
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动脉粥样硬化(AS)是指在动脉壁的内膜及其内膜下有脂质沉着,同时伴随中层平滑肌细胞转移至内膜下增生,使得内膜增厚,形成黄色状如同粥样物质的斑块;它是一种多病因所致的慢性炎症性疾病,其发病机制与氧化应激,免疫炎症反应,细胞凋亡,脂质代谢以及血流动力学改变等有关,是一个复杂的病理过程。另外在心血管系统中发现多种与动脉粥样硬化相关的microRNA,且在血中稳定存在,血液标本获取便捷。故某些易在血清中检出、并有可能预测心血管事件的microRNA可以为动脉粥样硬化的早期诊断和治疗提供新的线索[1,2]。

1、资料与方法

1.1研究对象

选择2016年1月至12月在我院做冠状动脉CT造影(CTA)检查且为冠状动脉粥样硬化的120例患者(冠脉粥样硬化组),其中男82例,女38例,平均年龄(51.06±10.23)岁;排除患有免疫、肿瘤、心衰、心肌梗死、心肌炎以及其他感染性疾病的患者;经过患者同意纳入研究,并经医院伦理委员会批准。另外从我院体检中心中筛选出100例健康人作为健康对照组,男60例,女40例,平均年龄(54.36±11.43)岁。两组患者一般资料差异无统计学意义(P均>0.05),具有可比性。

1.2研究方法

1.2.1血清标本的采集及保存:

所有受试者于第2天空腹采集全血,两管血量为5ml,离心分离血清,分为两份保存,检测各项指标。

1.2.2指标检测:

其中一管血清按照说明书规定应用酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C),试剂盒购自罗氏公司;酶联免疫法(ELISA)测定白介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量,试剂盒购自上海浩本生物科技有限公司;另取血清400μl,按照microRNA提取试剂盒(购自Ambion公司)说明书步骤对血清中microRNA进行抽提,提取液于-80℃冰箱冻存,然后进行逆转录聚合酶链式反应(PCR)。根据TLDA初步筛选试验检测各组血清中microRNA,分析样本中各microRNA的表达量,结果显示:在冠状动脉粥样硬化组患者的血清中检测到184种microRNA的表达(Ct值<40);在健康对照组混合血清中检测到252种microRNA的表达(Ct值<40)。以Ct值<35,并且相对变化倍数大于2为标准,发现冠脉粥样硬化组患者血清中共有81种microRNA的表达高于健康对照组。进一步对比各microRNA相对健康对照组的变化程度,同时参照相关的文献资料,选择与本研究相关的变化最为显著的三种microRNA,包括microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145,然后使用荧光实时定量PCR技术对microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145的表达进行实时定量,SYBR荧光染料购自Qiagen公司,其中逆转录PCR反应需要按照TaqManmicroRNA反转录试剂盒(购自AppliedBio-systems公司)说明书依次进行,其反应条件是16℃30min;42℃30min;85℃5min;4℃5min;另外荧光实时定量PCR反应按照TaqManmicroRNAAssayKit说明书进行操作,其反应条件是95℃10min,95℃15s,60℃1min,45个循环。以U6SnRNA作为内参;相对表达量计算公式为2-(Ct[microRNA]-Ct[U6])[3,4]。

1.3统计方法

所有数据采用统计软件SAS9.2处理。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,比较采用t检验,计数资料以百分率表示,比较采用χ2检验。相关分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组血清中microRNA-155,microRNA-143,microRNA-145的表达比较

与健康对照组比较,冠脉粥样硬化组中microR-155表达显著升高,microRNA-143,microRNA-145表达显著降低(P均=0.001)。见表1。

表1两组血清中microRNA-155,microRNA-143,microRNA-145的表达比较

2.2冠脉粥样硬化患者microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145表达与血脂、炎症因子水平的相关性

Pearson相关分析显示,冠状动脉粥样硬化患者中microRNA-155表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平呈显著正相关(r=0.627～0.737,P均=0.001),与HDL-C水平呈显著负相关(r=-0.668,P=0.001);microRNA-143和microRNA-145表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平呈显著负相关(r=-0.783～-0.311,P均=0.001),与HDL-C水平呈显著正相关(r=0.572,0.824,P均=0.001)。提示microRNA可作为临床评价动脉粥样硬化有效的诊断指标并为动脉粥样硬化发病机制提供临床依据。见表2。

表2冠脉粥样硬化患者microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145表达与血脂、炎症因子水平的相关性

3、讨论

各种研究表明细胞因子、炎性趋化因子在AS的发展中起着至关重要的作用[5]。AS的主要特点是在动脉管壁聚集经修饰后的低密度脂蛋白(LDL)形成粥样硬化斑块,被浸润的单核细胞逐步占领修饰后的LDL后变成泡沫细胞,这些泡沫细胞和其他免疫细胞产生促进慢性炎症和斑块增长的多种细胞因子;在炎症反应中黏附分子、细胞因子以及生长因子之间相互作用,触发及促进此炎症反应,这些炎症因子主要有TNF-α、白介素等[6]。近些年,microRNA在动脉粥样硬化研究中被广泛应用,它可以通过靶基因调控动脉粥样硬化的免疫炎症过程,抑制炎症因子分泌,抑制信号通路的活化,在一定程度上可以改善动脉粥样硬化的发展[7]。研究表明mcroiRNA-155的表达随着动脉粥样硬化炎症加重而升高,影响着炎症发应机制,与炎症因子的表达成正相关,使炎症因子IL-6和IL-8不断升高;IL-6主要于淋巴细胞中广泛表达,在动脉粥样硬化的发展过程中,IL-6通过诱导肝合成急性期蛋白如C反应蛋白上调黏附分子,削弱纤维帽,从而使斑块易发生破裂,致动脉粥样硬化进展[8]。而IL-8作为一种新型细胞自身调节因子,对嗜中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞同时具有趋化作用,并可显著激活嗜中性粒细胞,与IL-6及TNF-α类似,是参与机体炎症反应和一系列病理生理过程的重要介质,并加重动脉粥样斑块的不稳定性[9]。另外有研究表明在敲除mcroiRNA-143和microRNA-145的小鼠中,血管损伤后内膜增生无法进行。在动脉粥样硬化患者体内microRNA-143和microRNA-145的表达同TNF-α呈显著负相关;由于血清中microRNA-143和microRNA-145的表达显著下调,导致巨噬细胞数目升高,此刻巨噬细胞分泌的TNF-α水平将急剧上升,从而对内皮细胞产生毒性引发炎症反应,使血管内皮损伤,黏附分子上调进而形成更多巨噬细胞,产生更多TNF-α,如此恶性循环导致动脉粥样硬化进展加剧[10]。

本研究通过对冠状动脉粥样硬化患者体内microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145的定量分析,发现动脉粥样硬化患者体内microRNA-155表达显著上升,microRNA-143和microRNA-145表达显著下降。提示三者在冠状动脉粥样硬化的发生、发展及斑块破裂过程中发挥着重要的作用。而且,冠状动脉粥样硬化患者中microRNA-155表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平呈显著正相关,与HDL-C水平呈显著负相关;microRNA-143和microRNA-145的表达与IL-6、IL-8、TNF-α、TC、LDL-C水平呈显著负相关,与HDL-C水平呈显著正相关,提示microRNA-155、microRNA-143和microRNA-145对动脉粥样硬化的诊断具有重要意义。掌握microRNA以及其靶基因的表达调控机制,通过拟或抗microRNA技术,定性定量地抑制或上调目的靶基因的表达,从分子水平达到预防和治疗动脉粥样硬化的目的将可能成为今后临床研究的重要方向。

参考文献：

[4]宋翠珠,郭韧,张毕奎.MicroRNA对动脉粥样硬化发生的调控作用及其临床应用[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,29(1):13-18.

[5]于丽丽,赵捷,王慧媛,等.白介素与动脉粥样硬化相关性研究进展[J].实用药物与临床,2014,17(9):1182-1187.

[6]张艳,卢红,张萍,等.急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块稳定性与血清脂联素､白介素8水平的相关性[J].临床神经病学杂志,2012,25(3):174-176.

[7]项洋,姜明红,王东生,等.miR-146a对小鼠巨噬细胞IL-18表达的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(5):477-479.

[8]田恒松.老年冠心病患者血清中IL-8､IL-18和IL-20的表达及意义[J].中国老年学杂志,2012,32(5):1067-1068.

张帆,冷沁,方勇,贺立群,刘娟,李立为.MicroRNA在动脉粥样硬化临床诊断中的作用[J].心血管康复医学杂志,2021,30(01):35-38.