宫颈癌(CC)的发病率和死亡率均位居全球女性癌症第四位,仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。2018年全球约有57万新发病例,31万死亡病例[1]。持续的高危型人乳头瘤状病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素,其中70%的浸润性宫颈癌与HPV16和(或)18型感染相关[2]。HPV主要通过性生活传播,从HPV感染到宫颈癌的发生往往需要几年甚至十几年的时间,研制HPV预防性疫苗和治疗性疫苗逐渐成为宫颈癌防治的重要措施,也成为国内外学者关注的热点问题。

目前FDA批准上市的HPV预防性疫苗有针对HPV16、18型的二价疫苗(Cervarix)、针对6、11、16、18型的四价疫苗(Gardasil)以及针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的九价疫苗(Gardasil9),这三种疫苗的接种已经逐渐在全球范围内推广,并显示出很好的免疫原性和安全性[3]。截至2016年底,近70个国家在其国家免疫接种计划中引入了预防性HPV疫苗[4],但预防性HPV疫苗只对健康人群以及既往感染过HPV病毒的人群有预防作用,它们不能治疗现已感染HPV相关的病变[5,6],因此对治疗性疫苗的研制刻不容缓。本文旨对多种类型的HPV治疗性疫苗的临床研究现状及进展做一综述,为治疗性疫苗的研制工作提供参考。

1、人乳头瘤状病毒(HPV)特点

HPV是一种乳头瘤空泡病毒A属的双链球形DNA病毒,其结构简单、无包膜,其基因组编码了6种早期调控蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两种晚期结构蛋白(L1和L2)。早期基因编码蛋白负责病毒DNA复制、转录和致癌转化,晚期基因编码病毒衣壳蛋白。目前已经分离出超过200种HPV病毒类型,大约有40种类型与生殖道感染有关,根据其生物学特征和致癌潜能,可将其分为高危型和低危型。低危型HPV如6、11、42、43、44等,常引起外生殖器疣等良性病变;高危型HPV型别如16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等则与宫颈癌及宫颈上皮内病变有关。

2、HPV治疗性疫苗

HPV治疗性疫苗通过产生针对病毒颗粒的中和抗体来刺激细胞介导的免疫反应来明确目标并杀死受HPV感染的细胞。目前国内外已经展开HPV治疗性疫苗的研制主要有活载体疫苗(细菌、病毒载体疫苗)、肽和蛋白质疫苗(肽链型疫苗、蛋白质疫苗)、核酸疫苗(DNA疫苗、RNA疫苗)以及全细胞疫苗(树突状细胞疫苗、肿瘤细胞疫苗)等[6]。治疗性疫苗的靶抗原基因是E6、E7,其是将E6、E7抗原以多种形式传递给抗原呈递细胞(APCs),E6、E7抗原被蛋白酶体加工和消化成更小的缩氨酸,呈现在主要组织相容性复合抗体Ⅰ(MHCⅠ)分子上,激活HPV抗原特异性CD8+毒性T细胞或CD4+辅助T细胞产生免疫反应,从而杀灭靶基因E6、E7的HPV感染细胞和癌细胞[7]。

2.1肽和蛋白质疫苗

肽和蛋白质疫苗是将来自HPV抗原的肽和蛋白质由树突状细胞处理并呈现在MHCⅠ或Ⅱ分子上,以刺激CD8+或CD4+T细胞的免疫反应[6]。尽管肽链型疫苗是安全、稳定、易于生产的,但是其免疫原性差,需要脂质或其他佐剂(如趋化因子、细胞因子和Toll样受体)来增强疫苗效力[8]。不幸的是,肽链型疫苗是MHC特异性的,这意味着,每个HPV抗原都需要特异性抗原表位,这使其大规模生产和治疗HPV相关疾病时面临一定的挑战。一种可能的解决办法是应用重叠的长肽疫苗,该方法已在几种临床前模型中证明可有效诱导抗原特异性T细胞应答[8,9]。HPV16合成长肽疫苗(HPV16-SLP)由HPVE6和E7重叠肽和MontanideISA-51佐剂组成,其治疗效果已经在多个临床试验中得到广泛的研究[10]。在一项Ⅱ期临床试验对9名HPV16高级别鳞状上皮内病变(HSIL)接种HPV16-SLP疫苗,在接种后均显示强烈的HPV特异性T细胞反应[11]。PepCan是一种由四种合成多肽组成的治疗性疫苗,包括HPV16E6和新型佐剂Candin。在Ⅰ期临床试验研究中,招募31例HSIL患者检测PepCan的安全性,6例HSIL患者在12周内分别皮内注射50μg、100μg、250μg、500μg,每3周一次,最后一次注射后行宫颈锥切术。对10名经活检证实为HSIL的患者接种50μg的疫苗,观察到50%患者组织学的完全回归,85%患者病毒的清除,常见不良反应为轻至中度的注射部位反应[12]。目前正在进行一项新的临床试验,计划招募125名HSIL患者,以进一步评估PepCan联合佐剂Candin疫苗接种方案在HSIL患者在Ⅱ期临床试验中的有效性(NCT02481414)。

蛋白质疫苗包含了所有人类白细胞抗原(HLA)抗原表位,避免了MHC的限制,但是仍然存在免疫原性较低的问题[13]。GTL001是一种由HPV16和18E7蛋白组成的治疗性HPV蛋白疫苗。在一项I期临床试验中,将47名宫颈细胞学正常但HPV16或18阳性的女性分为四组,其中包括两组安慰剂组,给予每个参与者100μg或600μg的GTL001和咪喹莫特,研究表明给予600μg的GTL001和咪喹莫特的女性HPV16/18获得了最高的清除率,且该试验未出现严重的不良反应,该疫苗是相对安全的[14]。GTL001在随机双盲Ⅱ期临床试验中纳入233例宫颈细胞学正常或异常的HPV16/18阳性的患者,所有患者均接受力至少一剂疫苗或安慰剂,以及局部使用咪喹莫特,并在2年后进行病毒清除评估。GTL001组和安慰剂组的病毒清除率差异无统计学意义,进展为高级别病变的发生率相同,进一步的临床试验被停止(NCT01957878)[15]。然而,第二代疫苗已经开发出来。GTL002是由源于HPV16/18/45/31/33/52的改进的E7蛋白组成,其临床前免疫原性已在自交系小鼠和小猎犬中进行了评估,6种基因型可分别诱导E7特异性T细胞应答,并使用TC-1肿瘤挑战模型证实了其在体内的有效性[16]。

2.2活载体疫苗

活载体疫苗通过MHCⅠ和Ⅱ途径来驱动HPVE6、E7抗原呈递,分别刺激CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助T细胞,提供高水平的免疫原性,但是对免疫缺陷的患者存在潜在的安全风险,重复接种该类疫苗产生的免疫效应是有限的。根据载体的不同,分为病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。

现有的病毒载体包括腺病毒及其相关病毒、甲病毒、慢病毒和牛痘病毒[17,18]。牛痘病毒是一种属于痘病毒家的包膜型双链DNA病毒,它有一个很大的基因组,具有高度传染性,而且不受限制的将外来DNA整合到它的基因组中,是一个很有前景的疫苗接种的病毒载体[7]。近年来,已经建立并测试了几种经过改良的牛痘苗(MVA)治疗性HPV疫苗。TG4001是一种MVATG8042粒子的悬浮粒子,它由衰减的重组MVA组成,包括编码改进的HPV16E6/E7和IL-2。在Ⅱa期临床试验中招募了21例HPV16阳性的宫颈上皮内病变2/3级(CIN2/3)患者评估其安全性和有效性,48%显示疾病的消退,在10例低级别病变的患者中,8例出现HPV16DNA的清除,治疗12个月后未出现高级别病变的复发[19]。虽然这些数据是非常鼓舞人心的,但是本试验中没有报道免疫分析,也没有报道疫苗诱导的T细胞免疫与病毒清除之间的相关性。随后,在206例CIN患者中进行的随机双盲Ⅱb试验(NCT01022346)显示,接种疫苗者的组织学退化程度大于安慰剂组(25%vs10%,P=0.0126),接种6个月后病毒清除率也大于安慰剂组(37%vs14%)。

此外,MVAE2疫苗是将E2蛋白引入宿主体内,E2蛋白作为抑制剂,在HPV感染宿主后,抑制E6、E7癌基因蛋白的活动,随之减少受感染细胞的转化能力和与HPV感染相关的恶性肿瘤细胞的生存能力[20]。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中,对36例CIN1-3的妇女每周直接注射MVA-E2到子宫,注射6周,94%的患者在接受治疗后完全消除了宫颈癌前病变,其余2例患者从CIN3降到CIN1[21]。最近,MVA-E2疫苗已经在Ⅲ期临床试验中测试了1176名HPV感染相关的宫颈病变的女性患者和180名仅患有湿疣的男性患者,疫苗被直接注射到子宫、尿道、外阴或肛门,接受MVA-E2治疗后,89.3%的女性患者和55.5%的男性患者观察到完全的组织学回归。任何一项研究都没有提供E2特异性T细胞的描述,因为这些研究中没有使用对照疫苗,所以真正的疫苗效果还不确定[22]。

目前已用于治疗性疫苗研究的细菌载体有单核细胞增多性李斯特菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌等。细菌载体的生产相对简单、价格便宜、稳定、易于大规模生产[23]。李斯特菌是目前研究最广泛的细菌载体。ADXS11-001是一种通过表达HPV16E7抗原产生针对E7癌蛋白的免疫应答的李斯特菌载体疫苗。在Ⅰ期临床试验测试了15例转移性、难治性或复发性宫颈鳞癌患者,观察到3例患者E7特异性T细胞增加,4例患者肿瘤明显减小,结果表明了ADXS11-001在控制癌症进展方面可能具有一定的影响[24],仍有待科学界们进一步研究证明。肛肠、头颈和宫颈癌方面的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正中进行中(NCT02399813、NCT02002182、NCT02291055、NCT01266460),持续性或复发性转移性宫颈癌的患者参加了Ⅱ期临床试验,静脉注射ADXS11-001,其1年的总生存率为38%,高于预期的1年总生存率(24%)。目前将ADXS11-001作为放化疗后高风险的局部晚期宫颈癌患者的辅助免疫治疗的Ⅲ期临床试验正在进行中(NCT02853604)。另外,GLBL101c是一种基于HPV16E7的重组乳酸杆菌口服治疗性疫苗。在Ⅰ/Ⅱa期临床实验中给予17例HPV16阳性的CIN3级的患者该疫苗,其中有9例患者疾病转归到CIN2级,5例退化到低级别鳞状上皮内病变(LSIL),患者均未出现任何严重的不良反应,是否可以应用于临床还需要进一步的临床试验[25]。

2.3核酸疫苗

DNA疫苗作为一种潜在有效的抗原特异性免疫疗法,因其制造简单、制造成本低、安全、稳定、易于生产,且在细胞中能维持比RNA疫苗或蛋白质疫苗更长的免疫原性,此外,它们不会产生中和抗体,允许反复接种而越来越受欢迎[26]。GX-188E是一种基于HPV16/18E6/E7蛋白融合的治疗性HPVDNA疫苗。在Ⅰ期临床试验中,9例HSIL/CIN3级患者接种该疫苗,其中7例显示病变完全消退,接种者只有轻微的肿胀、发热、疼痛等反应,表明该疫苗的耐受性和安全性较好[27]。VGX-3100疫苗是由两个DNA质粒组成,编码HPV16和18型E6/E7两种抗原。在一项Ⅱ期临床试验中将167例HPV16/18阳性的CIN2/3级的患者随机分为疫苗接种组和安慰剂组(3∶1),在0周、4周、12周肌肉注射VGX-3100疫苗或安慰剂,随后给予电穿孔(电穿孔是一种作用于皮肤的简单的电脉冲,通过诱导细胞膜的瞬时渗透性,可以大大提高疫苗的吸收和随后的抗原传递,是一种佐剂[28]),53例疫苗接种者(49.5%)和11例安慰剂接种者(30.6%)出现了疾病的转归[29]。目前正在进行一项Ⅲ期试验,以证实VGX-3100在HPV16/18阳性的组织学证实为CIN2/3级的妇女在随后应用电穿孔治疗的有效性、安全性和耐受性,它的目标是招募198名患者,预计完成日期为2020年(NCT03185013)。虽然HPVDNA疫苗前期取得了较好的效果,但其仍存在免疫原性弱的问题,同时DNA编码的HPV致癌基因E6、E7可能会导致细胞转化的风险[7]。

RNA疫苗也是一种非常有利的疫苗接种方法。裸RNA复制疫苗可以从Sindbis病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、SemlikeForest病毒等病毒中提取获得[30]。RNA复制子具有自我复制的能力,可以导致持续的抗原表达以及增强免疫原性,此外,RNA复制子的载体不会形成病毒粒子,这意味着它们不会产生中和抗体,允许重复接种。而且它们不存在DNA疫苗产生的染色体整合和细胞转化的风险,但不足的是它的稳定性较低,迄今为止在临床环境中还没有探索出针对HPV抗原和HPV相关疾病的RNA疫苗[7]。

2.4树突状细胞疫苗

树突状细胞(DCs)疫苗的优点是树突状细胞可以作为天然佐剂来增强针对癌症的抗原特异性免疫疗法的效力[31]。也有研究表明中药及其成分具有免疫调节作用,尤其对DCs成熟的调节作用,其中马尾松多糖(PFPS)可以提高树突状细胞疫苗的抗肿瘤效果,其可能是DCs疫苗的一种潜在佐剂,为DCs疫苗更好地应用于人类提供可能[32]。在I期临床实验中对14例HPV阳性的晚期、复发性宫颈癌患者接种基于HPV抗原的DCs疫苗,14例患者中只有3名患者出现了0级和1级毒性,包括疫苗接种部位的瘙痒、发热、腹部不适和呕吐等[33]。此外,对10例Ⅰb或Ⅱa期宫颈癌患者接种基于HPV16/18E7抗原和血蓝蛋白的DCs疫苗进行I期临床实验,接种后的所有患者产生E7特异性CD4+T细胞免疫反应,其中8例产生E7特异性CD8+T细胞[34]。以上研究表明,DCs疫苗取得了很可观的试验结果,但是其在技术上要求严格,制作过程复杂,价格高昂,大规模生产不可行,且不同的培养技术可能会导致疫苗质量不一致,缺乏疫苗的评估标准[7],还需进一步研究。

3、问题与展望

迄今多种类型的治疗性疫苗已用于临床前期及临床试验,并呈现良好的安全性和耐受性,为宫颈癌的防治提供了可能,但是仍然存在很多问题有待进一步研究。首先,当前治疗性疫苗针对的靶抗原基因主要是E6、E7,其他靶抗原基因疫苗的研究较少[35],寻找新的靶点是很有必要的。其次,它们的免疫原性大部分较差,尤其是肽和蛋白质疫苗,需要脂质或佐剂以增强疫苗的效果。最后,疫苗诱导的T细胞的疗效可能会受到肿瘤利用的多种免疫逃避和免疫抑制机制的影响,需考虑调节肿瘤微环境调控机制的治疗方式,如利用调节性T细胞(Tregs)破坏局部免疫调节、利用卡铂联合紫杉醇、贝伐单抗等化疗药物增加疫苗的抗肿瘤作用、寻找新的个性化抗原等[23],这些研究尚不成熟,正在筹备当中。HPV治疗性疫苗的研制存在很多未知已知的挑战,真正用于广大患者仍需要很长一段时间。但相信随着疫苗研究的进一步深入,这些问题都会得到很好的解决。随着预防性疫苗接种、宫颈癌筛查工作逐渐在全球范围内的推广,相信在不远的将来宫颈癌的全球发病率和死亡率会显著下降。

参考文献：

[35]赵爽,赵方辉.HPV治疗性疫苗研究进展[J].中华预防医学杂志,2018,52(5):556-560.

徐晓琪,王志莲.HPV治疗性疫苗的研究进展[J].现代肿瘤医学,2020,28(18):3275-3278.