结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的慢性传染性疾病，人类以结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）感染最常见。MTB感染机体后，因其专性需氧的特性，通常以肺部感染最常见，即引起“肺结核”。MTB是单一病原体感染致死的主要原因之一，对人类健康与公共卫生安全造成了极大的威胁[1]，因此，采取有效的预防措施，减少宿主对MTB的易感性，对结核病的预防和控制具有重要意义。

“肺-肠轴”理论的提出，揭示了肠道菌群与肺部疾病的发展有关[2]，动物实验揭示了肠道菌群与肺结核之间的相关性，Winglee等[3]发现MTB感染会使小鼠肠道菌群种类与丰富度显著降低。宿主肠道菌群失调后，肺树突状细胞C型凝集素受体的表达下调，降低了CD4+T细胞的活化水平，进而增强了宿主对MTB的易感性[4]。猕猴的基线肠道菌群状况与MTB感染后的病情严重程度相关[5]，给肠道菌群失调的小鼠进行粪便移植或者补充植物乳酸杆菌（Lactobacillusplantarum）能够恢复小鼠的抗MTB免疫力[4]，这表明宿主肠道菌群失调可能会影响人类MTB感染后的疾病进展，以及导致宿主对MTB的易感性，但目前与之相关的临床研究少有报道。

高通量测序技术加速了人类对肠道微生态的理解，分析宿主在健康和患病状态时肠道菌群的组成，可以识别与疾病有关的肠道菌群改变，为疾病的预防和治疗提供新的干预措施。笔者基于临床研究收集29例肺结核患者与28名健康对照者的粪便进行高通量测序与生物信息学分析，对两组样本肠道菌群多样性、结构、细菌表型之间的差异进行分析，以期为结核病的治疗与预防提供新的方向。

材料和方法

一、材料收集

1．研究对象：

采集2020年4月14日至12月28日就诊于南华大学附属长沙中心医院29名确诊为初治菌阳肺结核患者（肺结核组）的粪便标本。采集同期在本院进行健康体检的28名志愿者（对照组）粪便标本。志愿者年龄、性别、居住地与纳入患者匹配。两组研究对象的一般资料见表1。

2．肺结核组纳入标准：

(1）年龄18～60岁；（2）肺结核诊断标准为《WS288—2017肺结核诊断》[6]，经利福平耐药基因检测、分枝杆菌快速培养、MTB核酸检测鉴定为MTB病原学阳性，结合胸部CT检查确定为肺结核患者；（3）既往无抗结核治疗史；（4)3个月内未服用抗生素与益生菌产品；（6）同意入组，签署知情同意书。对照组入组标准：（1）年龄18～60岁；（2）体检结果提示身体健康且无胃肠道疾病史；（3)3个月内未服用抗生素与益生菌产品；（4）同意入组，签署知情同意书。排除标准：（1）孕妇或备孕者；（2）精神障碍患者；（3）严重心、肝、肾等疾病患者；（4）使用免疫抑制剂患者；（5)3个月内参加其他药物临床实验患者。伦理学审核：该项目通过南华大学附属长沙市中心医院伦理委员会批准，伦理审批号：R201956。

二、研究方法

1．粪便标本采集：

表1一般资料在肺结核组和对照组中的分布情况

使用无菌棉签，于清晨采集对照组与肺结核组新鲜粪便1～2g置于细菌DNA保存液中，并立即转入-70℃冰箱保存待检。

2．粪便标本DNA提取与PCR扩增：

使用PowerMaxDNA(MoBio实验室，浙江杭州设备制备，批号：20190952）分离试剂盒从粪便样本中提取细菌全基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定所提取的细菌总DNA完整性后，使用NanoDrop?ND-1000分光光度计（美国赛默飞世尔科技有限公司）对所提取DNA进行定量，将细菌总DNA主带完整无污染的样本进行进一步检测。使用PCR扩增引物（正向引物515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，反向引物806R:5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′）对细菌总DNA中16SrRNAgeneV4区进行扩增建库。采用AgencourtAMPureXP60mlKit核酸纯化试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司）与QubitdsDNAHSAssayKit核酸定量检测试剂盒（美国生命技术公司）对PCR进行纯化与量化。依据靶标序列和引物序列获得原始资料中单个样本数据，去除靶标及引物序列后使用Vsearch(v2.4.4）对每份样本的碱基序列进行拼接，得到原始碱基序列。同时对原始碱基序列进行质量控制与过滤，去除低质量序列的标准为：序列<150bp，平均质量低于20bp，含有不明碱基序列，存在>80bp的单核苷酸重复序列，去除嵌合体后最终获得有效数据。IlluminaNovaseq6000平台对纯化后的细菌16SrRNAgeneV4区扩增产物进行测序。

3．生物信息学分析：

基于Sliva128数据库，通过Vsearch对代表序列进行物种注释，获得操作分类单位（operationaltaxonomicunits,OTU）物种信息，测序数据分析主要使用R软件包（v3.2.0）和QIIME软件。QIIME软件计算OTU水平α多样性指数、β多样性指数，及门、属水平的相对丰度，并生成OTU水平丰度等级曲线（rankedabundance）。R软件包“VennDiagram”生成韦恩图。R语言ggplot绘制属水平气泡图。BugBase细菌表型预测工具，获取微生物的7类表型信息，比较门水平下不同表型的细菌在各组的组成。

三、统计学处理

应用SPSS26.0进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以“±s”表示，非正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M(Q1,Q3）]表示，计数资料用“例/名，率（%）”表示；计数资料采用卡方检验，β多样性分析采用非参数多元方差分析（permutationalmultivariateanalysisofvariance,PERMANOVA）计算PcoA结果，以P<0.05为差异有统计学意义；计量资料正态性检验采用夏皮洛-威尔克检验（Shapiro-WilkTest,S-WTest），对于符合正态分布的数据采用独立样本t检验，不符合正态分布的数据，采用U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、OTU聚类与统计

57份粪便标本细菌16SrRNAgeneV4可变区扩增测序，总共获得7432960条有效序列（cleanreads），人均130403条Cleanreads。测序平均覆盖度为（94.51±0.15）%，足以说明样本所涵盖的肠道菌群类别。以≥97%的相似序列聚类为1个操作分类单位，表征物种的丰富程度和均匀程度的OTU丰度等级曲线与两组间OTU韦恩图共享情况见图1。

图1丰度等级曲线与韦恩图

二、肺结核患者肠道菌群多样性分析

β多样性利用主坐标分析（principal,PcoA）的降维分析方法，将所有样本置于差异可视化的二维坐标系中，这种非限制性排序，以样本的相似性距离为基础分析，点与点之间的距离远近代表样本之间的差异大小，基于加权距离（weightedunifracbasedPcoA）与非加权距离（unweightedunifracbasedPcoA）观察到两组样本各自聚类，PERMANOVA算法（R2=0.253,P=0.001）表明肺结核组与对照组肠道菌群构成差异有统计学意义，见图2。α多样性指数是用以描述组间肠道菌群种类（多样性）与数目（丰富度）的指标，其中香农（Shannon）指数、辛普森（Simpson）指数反映群落的多样性，Chao1指数和ACE指数反映群落的丰富度。对照组与肺结核组相比，差异均有统计学意义（P<0.01），见表2。

图2β多样性分析

三、肺结核患者肠道菌群门水平构成分析

共检测出17种菌门，其中拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）、TM7、互养菌门（Synergistetes）、软壁菌门（Tenericutes）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae）为队列中丰度前10位的菌门。拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，对照组中总占比为98.50%，肺结核组中为93.05%。拟杆菌门对照组中占比为42.74%，肺结核组中为44.84%；厚壁菌门对照组中占比为51.55%，肺结核组中为35.44%；变形菌门对照组中占比为4.21%，肺结核组中为12.77%，见图3。其中，肺结核组肠道菌群中厚壁菌门（35.44%）明显低于对照组（51.55%），差异有统计学意义（Z=-3.290,P<0.01）。

四、肺结核患者肠道菌群属水平构成分析

共检测到253种菌属，其中肺结核组与对照组差异菌属共12种，分别为双歧杆菌属（Bifidobacterium）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、臭杆菌属（Odoribacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、Anaerostipes、劳特氏菌属（Blautia）、粪球菌属（Coprococcus）、毛螺菌属（Lachnospira）、罗氏菌属（Roseburia）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、真杆菌属（Eubacterium），见表3。

五、基于BugBase表型分类的肠道菌群功能预测

与对照组比较，肺结核组患者肠道中厌氧菌（Anaerobic）基因相对丰度与革兰氏阳性菌（Grampositive）基因相对丰度均降低，兼性菌（Facultativelyanaerobic）基因相对丰度与革兰氏阴性菌（Gramnegative）基因相对丰度均增高，生物膜形成能力（Formsbiofilms）的细菌基因相对丰度增高，肠道菌群氧化胁迫（stresstolerant）耐受能力增强。此外，需氧菌（Aerobic）基因相对丰度与具有移动组件（Containsmobileelements）的细菌基因相对丰度升高，具有潜在致病性（Potentiallypathogenic）细菌的基因相对丰度增加，但差异无统计学意义，见表4。

表2α多样性指数在肺结核组与对照组中的比较

表3肠道菌群属水平相对丰度在肺结核组与对照组的比较

图3门水平组间菌群构成差异分析

表4肠道菌群表型相对丰度百分比在肺结核组与对照组的比较

讨论

结核病作为一种慢性消耗性疾病，其疾病的预后与人体自身的营养免疫状况密切相关，肠道作为人体最大的黏膜系统，富含丰富的肠道菌群，肠道菌群通过黏膜免疫系统，以及分泌代谢产物由血液循环到达全身各处，参与宿主的营养免疫调节，对宿主健康至关重要[7]。笔者应用高通量测序技术与生物信息学分析对肺结核患者肠道菌群总体组成与细菌表型进行分析。肠道菌群多样性研究结果表明，肺结核患者肠道菌群与健康对照者相比α多样性下降，β多样性存在明显差异，这表明在肺结核感染的病理状态下，患者出现明显的菌群种类与丰度下降或者定植困难，其原因可能与病原体感染激活全身免疫系统，机体发生应激反应而引起菌群种类与丰度下降有关[8]。

肠道菌群构成分析显示，拟杆菌门与厚壁菌门为两组的优势菌门，占总菌门数的85%以上，其次为变形菌门、梭杆菌门与放线菌门。其中，两组间差异菌门为厚壁菌门，肺结核患者肠道内厚壁菌门丰度明显低于健康对照组，这与Wu等[9]对肺结核患者痰标本菌群变化的研究结论一致。厚壁菌门是人类肠道菌群中丰度最高的菌门，占肠道菌群的20.5%～80%，大部分肠道短链脂肪酸（shortchainfattyacids,SCFAs）产生菌与益生菌均属于厚壁菌门[10]。此外，健康人的肠道菌群厚壁菌门比例通常较高[11]。研究表明，若疾病状态下机体肠道内厚壁菌门比例降低，则会引起胃肠道代谢异常，并导致血液循环系统中SCFAs的浓度降低，进而影响宿主免疫系统和全身炎症因子的组成[12]。肺结核患者肠道菌群厚壁菌门丰度降低提示肺结核患者肠道菌群紊乱，可能会导致机体免疫功能受损[10]。

两组间差异菌属共鉴定出12种，其中双歧杆菌属属于放线菌门，副拟杆菌属与臭杆菌属属于拟杆菌门，梭状芽胞杆菌属、Anaerostipes、劳特氏菌属、粪球菌属、毛螺菌属、罗氏菌属、粪杆菌属、瘤胃球菌属、真杆菌属均属于厚壁菌门。双歧杆菌是一种益生菌，研究表明双歧杆菌在小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染中具有促进机体产生抗体和γ-干扰素（INF-γ），增强自然杀伤细胞活性的有益作用[13]，除了对抗细菌感染，双歧杆菌还可以通过诱导Treg细胞的产生减轻哮喘小鼠模型的肺部病理改变[14]，这表明肺结核患者肠道双歧杆菌下降，可能不利于疾病的预后。差异菌属中SCFAs产生菌包括：梭状芽胞杆菌属[15]、毛螺菌属[16]、罗氏菌属[16]、瘤胃球菌属[16]、真杆菌属[16]、粪杆菌属[16]、劳特氏菌属[17]、粪球菌属[17]、Anaerostipes[18]，其中只有Anaerostipes、真杆菌属在肺结核组呈现上升的趋势，其余菌属均较健康对照组下降，因罗氏菌属、毛螺菌属、瘤胃球菌属为人体肠道内主要的SCFAs产生菌[19]，推测肺结核组肠道内SCFAs产生下降。文献报道，SCFAs至少通过两种机制作用于免疫和内皮细胞：激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白去乙酰化酶，其与各种类型的免疫细胞功能及宿主的免疫应答相关[20]，并可抑制肠道病原体定植，维持肠上皮屏障完整及为肠细胞提供能量[21,22]。在炎症性肠病、结直肠癌和糖尿病等炎症相关疾病患者的肠道菌群中也观察到SCFAs产生菌丰度的降低[23]。结核病患者SCFA产生菌的下降可能表明全身炎症加剧和全身免疫反应受损，从而对肺结核患者产生不利影响。然而，Segal等[24]发现，艾滋病患者口腔以及肺部的厌氧菌通过发酵SCFAs，从而诱导HIV感染患者外周血调节性T细胞（Tregs）分化，以及抑制外周血单个核细胞中IFN-γ和IL-17A的产生，增加HIV感染患者对MTB的易感性。同样，Lachmandas等[25]在肺结核与糖尿病共病患者体内发现，丁酸盐可降低MTB诱导的促炎细胞因子反应，同时增加IL-10的产生，增加宿主感染结核病的风险。因此，SCFAs可能在肺结核与其他疾病共病患者体内发挥不利作用，SCFAs产生菌在肺结核患者，以及在肺结核与其他疾病共病患者体内的具体作用还需进一步研究证实。

BugBase是一种微生物表型预测工具，基于OTU物种信息可对人类肠道菌群的功能进行预测，本研究中BugBase分析结果显示，肺结核患者肠道菌群生物膜形成能力增强、革兰氏阴性菌比例增加、氧化胁迫耐受，综合两组的氧需求（需氧菌、厌氧菌、兼性菌）表型来看，肺结核患者肠道菌群厌氧菌减少，兼性菌增加，提示肺结核组患者肠道菌群氧耐受能力明显提高，该能力的提高预示肺结核组患者肠道菌群处于紊乱状态[26]。正常情况下，肠道是一个高强度的厌氧环境，肠道微生物主要由厌氧菌组成，当肠道理化环境，如pH值、离子浓度、水分、肠道通透性等的改变会引起肠道氧气增多，而人体肠道内的条件致病菌氧耐受程度远大于肠道正常菌群[27]，氧动力学在调节肠道动态平衡中起着核心作用，氧梯度的破坏是引起许多肠道疾病的原因，包括炎症性肠病和大肠癌等[28]。肺结核患者肠道菌群中需氧菌及兼性厌氧菌丰度增高，提示肺结核患者的肠道微生态环境中氧含量的增加，这种改变可能是肺结核患者感染MTB的因素之一。

本研究存在一定的局限性，仅初步发现肺结核患者肠道菌群组成及表型与健康对照者存在区别，尚不能确定这种变化的发生是在MTB感染之前还是之后，后续仍需动物实验进一步验证两者之间的因果关系。并且受试者未进行标准化饮食，而饮食对个体肠道菌群具有一定的影响[29]。同时，由于不是16S全长测序，16SrRNAV4对菌群的分辨率较低，无法鉴定到种水平，且16S是存在于所有细菌中的一段序列[30]，无法鉴定肠道微生物中寄生虫、病毒、真菌，选择宏基因组测序可以对样本中所有微生物进行鉴定。但细菌16S序列具有高度的相似性，对16SrRNAV4区测序，可以将肠道菌群鉴定到属水平[31]，且其测序成本远低于宏基因测序，目前仍广泛应用于鉴定疾病状态下患者与健康对照者肠道菌群的差异性研究中。

综上所述，本研究发现在疾病状态下，肺结核患者存在肠道菌群组成及细菌表型改变，肺结核患者肠道菌群多样性下降，菌群定植能力低于健康人。菌群组成水平上SCFAs产生菌相关的细菌丰度下降，目前已有研究证明补充益生菌能增强宿主的抗结核免疫力[4]。本研究为探索微生态疗法在肺结核疾病中的治疗提供了一定的研究思路。

文章来源:易一行,喻容,石国民,马小华,肖四方,税剑,范任华,向延根.基于16SrRNAV4区高通量测序的初治菌阳肺结核患者肠道菌群构成与表型分析[J].中国防痨杂志,2021,43(09):939-946.