目前，耐药结核病形势依然严峻[1]。结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）在获得耐药性的同时，也需要不断进化其菌株毒力和适应性[2,3]，使其菌体能够逃避和适应巨噬细胞内恶劣的酸性环境、抑制吞噬体融合、躲避活性氧或者活性氮中间产物的杀伤作用[4]，以达到在免疫力低下患者体内长期潜伏，甚至发展成为持留状态的目的[5]。这些改变可由其自身的耐药基因引起，也可由其他的突变造成[6,7]。

近年来，随着抗结核新药广泛且长期的应用，对利奈唑胺（linezolid,Lzd）、pretomanid(PA-824）、氯法齐明（clofazimine,Cfz）、贝达喹啉（bedaquline,Bdq）耐药的菌株已时有报道[8]。对这些耐药菌株毒力的研究，可以更好地了解耐药过程中菌体的适应性、毒力变化及对机体致病能力的强弱，为菌株毒力改变的机制研究提供依据。笔者通过小鼠生存实验绘制临床耐药分离株及实验室诱导耐药菌株生长曲线，测定巨噬细胞内MTB菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）计数、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）的释放量及其在小鼠体内的毒力变化情况，以评价不同耐药类型MTB菌株的毒力变化与耐药种类及数量的关系。

材料和方法

一、实验菌株、细胞及动物

选取MTB标准株H37Rv(ATCC27294,1株）、减毒株H37Ra(ATCC25177,1株）、单耐Lzd菌株（L1,1株）、单耐PA-824菌株（P1,1株）、单耐PBTZ-169(macozinone,MCZ）菌株（169-1、169-2、169-3，各1株）、耐LPDR菌株（同时耐Lzd和PA-824，分别为PL1、PL2、PL3，各1株）、耐多药（multidrug-resistant,MDR）菌株（15833和16030，各1株）、准广泛耐药（pre-extensivedrugresistance,pre-XDR）菌株（17080和30744，各1株），共计14株作为实验菌株。所有菌株均为北京市结核病胸部肿瘤研究所药物学研究室保存菌株；其中15833、16030、17080和30744菌株为临床分离耐药株，单耐Lzd、单耐PA-824、单耐PBTZ-169和耐LPDR菌株为实验室诱导耐药株（来源于H37Rv）。单核鼠源巨噬细胞（J774A.1）购自北京协和细胞资源中心。BALB/c小鼠（168只，6～7周龄，体质量16～18g/只；分为14组，每组12只）均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

二、实验药品

利福平（rifampin,RFP；批号：014M2578V）、异烟肼（isoniazid,INH；批号：MKcl5638）、乙胺丁醇（ethambutol,EMB；批号0000086360）、链霉素（streptomycin,Sm；批号000083719）、莫西沙星（moxifloxacin,Mfx；批号：BCB23918）、左氧氟沙星（levofloxacin,Lfx；批号：089M4779v);PA-824（批号20190528）、Lzd（批号AOX137）购于美国ArkPharm公司。PBTZ-169为全球结核病药物研发联盟惠赠。

三、主要试剂和仪器

1．试剂：

Middlebrook7H9培养基（批号：8341764）、7H10培养基（批号：9148924）、OADC增菌液（批号：92006278）均购自美国BD公司；RPMI细胞培养液（批号：AD21582265）购自美国GE公司；胎牛血清（批号：42F1476K）购自美国Gibco公司。

2．仪器：

多功能酶标仪（型号：InfiniteM200pro，瑞士迪肯公司），电热水浴锅（型号：WBK-3B，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

四、研究方法

1．最低抑菌浓度（MIC）检测：

采用微孔板阿尔玛蓝显色法（microplateAlamarblueassay,MABA）。10%二甲基亚砜（DMSO）配置药物储备液，使用前稀释至所需浓度。设置阴性对照孔和阳性对照孔，将药物在96微孔荧光板进行二倍稀释至相应浓度后，每孔加入100μl菌液和100μl7H9培养基。置于37℃恒温培养箱7d，向各孔加入20μl阿尔玛蓝和12.5μl吐温-80（利于菌液悬浮），37℃孵育24h，用酶标仪测定各孔的吸光度值（A590值），并计算药物对菌株的MIC值。

2.MTB菌株生长曲线的绘制：

该实验通过测量菌株体外繁殖能力，来反映菌株对体外环境的适应性。将菌株培养至对数生长期，此时菌原液浓度适中，使用酶标仪测量其浓度的A570值（0.1=1×107CFU/ml）。根据浓度与体积公式（终浓度×20ml/原菌液浓度）取一定体积的原菌液接种于20ml新配置的7H9液体培养基中并加入2ml甘油混匀，使最终新培养基测得的A570值为0.01（即终浓度为1×106CFU/ml），同时使用摇床使菌液分散混匀。再取100μl的7H9液体培养基接种至7H10固体培养基中，为实际感染菌量。选取第0、3、7、14、21、28天时菌液倍比稀释接种至7H10固体培养基中，置于37℃5%CO2恒温箱培养，3周后进行CFU计数，将实验结果取对数，使用GraphPadPrism8.0绘制菌株28d时的生长曲线[8]。

3．巨噬细胞内MTB的CFU计数[9]:

该实验通过测量菌株胞内繁殖能力，反映菌株在胞内的生存适应性。选取生长状态良好的J774A.1巨噬细胞，将其消化后收集至离心管内，巨噬细胞稀释浓度为4×105个/ml，以每孔1ml将其铺于48孔透明微孔板内，置于37℃5%CO2培养箱中培养24h。按照巨噬细胞与MTB浓度比值（MOI）为1∶1作为最佳浓度（即菌液浓度4×105CFU/ml），将MTB与巨噬细胞置于37℃5%CO2培养箱中共同培养，4h后使用无菌磷酸盐（PBS）清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI细胞培养基，重新置于37℃5%CO2培养箱培养。2d后将细胞裂解，每孔取100μl进行倍比稀释。取50μl接种于7H10固体培养基上，3周后进行CFU计数。

根据预实验结果发现，当MOI为1∶1时，培养2d的巨噬细胞生长状态最佳，细胞损伤程度较小，LDH的释放程度也较低。而随着菌液密度的增大或培养天数的增加，细胞生长状态不稳定现象逐步增加，甚至出现细胞营养不良、贴壁不牢固而加大细胞损失的情况，同时LDH的释放程度也逐渐升高。

4．巨噬细胞LDH释放程度测定[10]:

该实验通过测定巨噬细胞的损伤程度，反映菌株对巨噬细胞的毒力程度。将巨噬细胞浓度稀释为4×105/ml，铺于96孔透明微孔板内，设置阴性对照孔和阳性对照孔（添加10μl细胞裂解液）。将各耐药菌株浓度稀释为4×105CFU/ml(MOI=1∶1），铺于实验孔和阳性对照孔，共孵育4h后使用PBS清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI细胞培养基。置于37℃5%CO2培养箱中，培养2d。将上清液以50μl/孔转移至新的酶分析板中，添加底物50μl/孔。室温避光孵育30min后于每孔加入50μl终止液，在波长490nm处检测其吸光度值（A490值），以及实验组（含菌液孔）与巨噬细胞最大释放组（阳性对照孔）吸光度值的比值，并以此为测量结果。

5．小鼠生存期测定：

小鼠生存曲线为菌株毒力判断最重要的指标。将各耐药菌株在培养基中培养至对数生长期，使用酶标仪测量其吸光度值（A570值），并使用无菌生理盐水将菌液浓度配制成1×108CFU/ml。使用摇床将菌液混匀后，以尾静脉注射的方式感染BALB/c小鼠，每只小鼠注射菌量为0.2ml(1×108CFU/ml,5×107CFU/只）；同时将各菌株倍比稀释后接种于7H10固体培养基，3周后进行CFU计数（以验证小鼠初始感染菌量）。观察8周，记录小鼠死亡情况。小鼠实际初始感染菌量依据文献[11,12]选择1×107CFU/ml～1×108CFU/ml，此浓度下每组小鼠生存期差异明显，剂量选取可行。

五、统计学处理

采用GraphPadPrism8.0软件进行数据绘图，使用SPSS22.0软件进行数据统计。由于本研究CFU计数实验工作量较大，以及实验时间的原因仅得到3次独立有效的实验数据，无法得到每份样本的四分位数结果，无法进行非参数检验，但可以按照正态分布的计量资料使用两独立样本t检验。而LDH释放实验得到7次结果，且符合正态分布，均以“±s”表示，各菌株数据与标准菌株H37Rv的比较采用两独立样本t检验。使用Kaplan-Meier生存分析方法绘制小鼠生存曲线，并通过log-rank法（又称时序检验）进行差异性比较。均以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、菌株表型耐药情况

标准株H37Rv和临床分离株耐药类型及MIC值见表1。实验诱导耐药菌株对Lzd、PA-824或PBTZ-169药品耐药类型及MIC值见表2。结果显示，不同耐药菌株的毒力均较标准菌株有所下降，且15833、16030、17080、30744耐药种类分别为2种、3种、5种、5种（表1、2）。

二、MTB体外生长曲线

MTB体外第0天实际菌量计数约为1×105CFU/ml，根据不同菌株在不同时间的胞内CFU计数结果和生长曲线观察到，经过28d的培养，14株菌株体外生长趋势一致，大部分在第7～14d即进入平台期。其中，减毒株H37Ra生长较缓慢，临床分离株30744菌株体外生长繁殖能力最低，体外生存适应性最差，具体见表3，图1～3。

表1结核分枝杆菌H37Rv标准株和临床分离耐药株对各药品的MIC值（μg/ml)

表2结核分枝杆菌H37Rv标准株、H37Ra减毒株和实验室诱导耐药株对各药品的MIC值

表3不同研究菌株在不同时间的胞内CFU计数结果（log10CFU/ml,±s)

三、MTB胞内繁殖能力和对巨噬细胞的毒性

巨噬细胞被MTB感染2d后，临床分离株和PL1、PL3、PL2的胞内CFU均低于H37Rv标准株，胞内繁殖能力均降低，差异均有统计学意义；H37Ra减毒株的胞内繁殖能力也明显低于H37Rv标准株，见表4。同时，各类型菌株LDH的释放量均明显低于H37Rv标准株，其中，H37Ra感染组LDH释放量最低，细胞损伤程度最低，见表5。

表4不同类型结核分枝杆菌感染巨噬细胞2d后胞内CFU计数情况

表5不同类型结核分枝杆菌感染巨噬细胞2d后巨噬细胞释放乳酸脱氢酶情况

四、小鼠生存分析

1．小鼠半数生存期情况：

各实验菌株感染小鼠后分别观察56d。发现H37Rv标准株感染的小鼠半数生存期为12d，第18天全部死亡；H37Ra减毒株感染后，直至实验结束无小鼠死亡；其他耐药株感染小鼠后，小鼠的半数生存时间见表6，使用Kaplan-Meier生存分析方法绘制小鼠生存曲线，见图4,5。

图1结核分枝杆菌H37Rv标准株、H37Ra减毒株和耐药临床分离株体外生长曲线

图2结核分枝杆菌H37Rv标准株、H37Ra减毒株及对Lzd、PA-824和LPDR耐药菌株生长曲线

图3结核分枝杆菌H37Rv标准株、H37Ra减毒株及对PBTZ-169耐药菌株生长曲线

图4小鼠感染结核分枝杆菌临床耐药分离株后的生存曲线

注以H37Rv标准株、H37Ra减毒株作为对照

图5小鼠感染结核分枝杆菌实验室诱导耐药株后的生存曲线

表6小鼠感染不同类型结核分枝杆菌后的存活状态及半数生存期

2．小鼠生存曲线分析：

观察图4发现，与H37Rv相比，所有临床分离株组小鼠生存时间均延长，其中，Pre-XDR菌株感染小鼠的存活时间长于MDR菌株，以30744临床分离株组小鼠存活时间最长；经log-rank法分析各菌株间小鼠8周内生存期分布情况，差异均有统计学意义（P值均<0.05），见表7。

观察图5发现，对于实验室诱导耐药菌株，单耐PA-824菌株P1感染小鼠后，小鼠的存活时间最短；而PL1、PL3菌株感染小鼠后，小鼠的存活时间长于其他实验室诱导耐药株，且PL1菌株感染小鼠后，直至实验结束时未达到半数死亡，即双重耐药菌株LPDR组小鼠存活时间>PBTZ-169耐药菌株组=单耐Lzd组>单耐PA-824耐药菌株组。通过log-rank法分析各菌株间小鼠8周内生存期分布情况，差异均有统计学意义（P值均<0.05），见表8。

五、菌株耐药数量与其毒力大小的关系

通过12株耐药菌对药物的MIC结果和以上对菌株毒力的检测结果，发现pre-XDR菌株（30744和17080）的毒力弱于MDR菌株（15833和16030），双重耐药菌株LPDR的毒力<单耐PBTZ-169菌株=单耐Lzd<单耐PA-824菌株。呈现出随着耐药数量的增加菌株毒力下降程度更明显的现象（图6）。

表7H37Rv、H37Ra和临床分离株感染的小鼠8周内生存期分布的log-rank法分析结果

表8H37Rv、H37Ra和实验室诱导耐药菌株感染的小鼠8周内生存期分布的log-rank法分析结果

图6不同耐药菌株毒力强弱与耐药品数量的关系

讨论

MTB的毒力因子与感染宿主相互作用，可导致宿主相应组织出现病理性损伤。文献报道，不同的MTB耐药株可出现毒力的不同改变[3,13]，从而影响菌株的致病能力，如fadD26、fadD28、mas、mmpL7等毒力基因的改变会影响MTB邻苯二甲酸硫菌酯（PDIM）的合成，降低菌株在巨噬细胞内的繁殖能力，对活性氧和活性氮中间产物的抵抗能力降低，从而降低菌株的致病能力[14]。也有研究认为，参与菌株氧化应激反应的转录调节因子sigma家族中sigF基因毒力位点的突变菌株也可引起小鼠脾肺的损伤[15]。而katGS315T位点的突变相较于其他katG基因位点，其适应性较高且毒力的改变较低，因此，该位点的突变在MDR-MTB菌株中广泛存在[16,17,18]。另有文章分析了332株利福平耐药菌株，其中rpoC基因补偿突变占比最大，如在俄罗斯[19]、哈萨克斯坦[20]、非洲[21]的研究中大约90%的补偿突变发生在rpoC基因中。因此，菌株毒力和适应性的改变可以影响菌株在人群中的流行。强毒株在巨噬细胞内可大量繁殖，极易在患者体内播散；而毒力和适应性减弱的菌株，其生存能力明显降低，有利于用其进行毒力和致病因子的研究。故本研究选择耐药菌株以研究其毒力的变化情况，为耐药菌株对机体的发病机制和耐药结核病的防治提供依据，至于菌株毒力是否还受其他因素及位点改变的影响还需在后续实验中进一步研究。

本研究发现，大部分临床耐药分离株体外生存适应性与H37Rv标准株一致，但30744菌株体外生存适应性较差，其对Km的MIC值（22.03μg/ml）明显高于其他临床株对Km的MIC值，但对Mfx和Lfx的MIC值（分别为0.03和0.18μg/ml）明显低于17080菌株（分别为0.61μg/ml和3.34μg/ml）。这提示30744菌株对注射类抗结核药品的耐药适应性要低于对氟喹诺酮类药物。但考虑到单个菌株实验的局限性，需进一步重复实验加以验证。

有研究认为，MTB产生耐药的同时会造成其适应性的降低[22,23]，但本研究中大部分临床耐药分离株的适应性并无明显降低，究其原因：（1）补偿突变现象可使菌株适应性恢复正常，如INH发生katG突变耐药的同时可伴随ahpC基因的表达上调，从而使其适应性恢复[24]；但目前除对利福平的适应性代偿研究较多外，对其他药物耐药的相关研究均较少，本研究仍倾向于可能存在补偿性突变。（2）临床耐药分离株的适应性高低主要由其异位显性作用决定[25]，即耐药菌株适应性的改变不是由单一位点决定的，而是菌株耐药和适应性相关位点及菌株背景信息综合作用的结果[26]。因此，也可认为本研究选取的临床耐药分离株适应性并无明显降低，可能是异位显性作用的综合结果。

研究显示，临床耐药分离株胞内繁殖能力均低于标准菌株，说明其不能很好地耐受巨噬细胞内的酸性环境[27]，其对巨噬细胞的毒力降低。分析其原因可能有：（1）笔者选取的菌株均为INH耐药菌株，在产生耐药的同时也会影响过氧化物酶-过氧化氢酶途径，导致其不能有效抵抗胞内的酸性环境，从而影响菌株抵抗氧或者活性氮的杀伤作用[28,29]。（2)MTB可以通过分泌酸性磷酸酶，水解吞噬体膜上脂类蛋白PI3-P，抑制吞噬溶酶体的融合，抵抗杀伤作用。但对于实验室诱导单耐Lzd、PA-824、PBTZ-169菌株的胞内繁殖能力除耐LPDR菌株明显降低外，其他均与标准株相似，考虑与耐药菌株相关基因突变有关，且突变基因的数量越多可能引起巨噬细胞内对抗上述机制的作用越弱，从而出现LPDR菌株较单一耐药菌株胞内繁殖能力的下降。

巨噬细胞的破坏会释放大量的LDH，该物质的吸光度值在490nm处存在特异吸收峰，因此检测反应体系中吸光度值的变化可以直接反映巨噬细胞死亡程度的高低[30]。本研究显示，所有耐药株感染巨噬细胞后LDH的释放量均明显低于H37Rv，提示耐药株对巨噬细胞的破坏程度均较轻，对其细胞毒力均减弱。

小鼠半数生存期分析结果显示，耐药株感染小鼠后的生存时间均明显长于H37Rv，这与文献[14]报道一致；且感染30744和17080菌株的小鼠较感染15833和16030菌株的小鼠存活时间长，提示30744和17080菌株的毒力均较弱；而双重耐药LPDR菌株感染小鼠的存活时间>单耐PBTZ-169=单耐Lzd>单耐PA-824耐药菌株，提示双重耐药菌株的毒力低于单耐药菌株。另外，结合菌株MIC值和巨噬细胞实验，结果显示，耐药数量越多的菌株，其感染小鼠后半数生存时间越长，也提示耐药数量越多的菌株其毒力越弱。由此认为，菌株的耐药数量可能与菌株的毒力呈负相关。但在对耐LPDR菌株的测定中发现，PL1和PL3组小鼠生存时间明显长于PL2组，可能与诱导过程中PL1和PL3产生了对其他药物的耐药有关，但因本研究未对PL耐药株进行对其他药物的MIC检测，尚不能完全确定相关性。

本研究通过细胞实验及动物实验仅初步评价了MTB临床耐药株、实验诱导耐药株相较于标准株的毒力变化情况，而对耐药株毒力减弱的原因、突变形式，以及适应性的改变与菌株毒力大小的关系未进行深入探究。在未来的研究中，笔者认为可以通过菌株全基因组测序等生物学技术筛选出毒力相关耐药突变位点，再通过敲除、回补或者过表达筛选基因，以观察该位点对菌株毒力的影响。

综上，笔者通过对MTB临床耐药分离株和耐Lzd、PA-824、LPDR及PBTZ-169菌株的生长繁殖能力、巨噬细胞的损伤程度，以及感染后小鼠生存时间的测定，初步了解了这些菌株的致病能力，发现相较于MTB标准株，抗结核新药耐药株的毒力均明显下降，且其毒力的大小与耐药的数量呈负相关。此结论可能为MTB耐药株的发病机制研究和防治提供依据。

文章来源:周莹宇,付雷,张炜焱,王彬,陈曦,陆宇,陈效友.不同耐药类型结核分枝杆菌毒力变化的初步研究[J].中国防痨杂志,2021,43(09):952-960.