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胎盘差异化长链非编码RNA在重度子痫前期发生和发展中的作用

2021-01-25 246 上传者：管理员

摘要：目的：研究重度子痫前期患者胎盘组织差异长链非编码RNA(lncRNA)/mRNA表达谱，分析其可能的作用机制，探讨其靶基因及小分子药物相关lncRNA。方法：选取2018年5月-2019年5月在潍坊市妇幼保健院治疗的30例重度子痫前期患者为子痫前期组，另选取同期在该院健康产前检查的孕妇30例为对照组，取患者胎盘组织。利用lncRNA/mRNA差异表达谱，筛选差异表达的lncRNA并进行靶基因预测，GO与KEGG富集分析分别预测靶基因的生物学功能及富集的信号通路。构建显著相关的小分子与lncRNA功能关联网络。结果：获得与重度子痫前期胎盘相关的差异表达lncRNA共21个(P<0.05)。GO与KEGG富集分析发现:重度子痫前期与内皮细胞损伤、炎症反应、免疫调节功能异常及滋养细胞侵袭异常等有关。靶基因PPI网络构建结果显示:差异表达lncRNA/mRNA与细胞生长、趋化等密切相关。结论：重度子痫前期患者胎盘中差异表达的lncRNA可通过靶向调控其靶基因参与调控多种生物学功能级相关信号通路，在重度子痫前期的发生发展过程中发挥重要作用。

关键词：
妇科疾病
差异长链非编码RNA
重度子痫前期
靶基因
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子痫前期是妊娠期的一种严重并发症，通常在妊娠20周以后出现，主要特征为高血压和蛋白尿，是导致孕产妇和围生儿发病乃至死亡的重要原因之一[1]。目前关于子痫前期的发病机制尚未明确，仍缺乏有效的诊断和治疗手段，终止妊娠是根本解决方法[2]。近年来研究认为，子痫前期患者胎盘组织的基因表达和表观遗传与正常妊娠者胎盘存在显著差异[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码蛋白的基因，其在表观遗传学和转录水平等生物学功能中发挥重要作用[4]。目前，关于lncRNA在子痫前期中表达和功能的研究较少。本研究测定子痫前期患者和正常孕产妇胎盘组织中lncRNA和mRNA表达谱，通过富集分析和网络构建等方法筛选出与子痫前期相关的lncRNA及可能的靶基因。现将研究结果报道如下。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2018年5月-2019年5月在潍坊市妇幼保健院治疗的重度子痫前期患者30例为子痫前期组，年龄35～39岁，足月分娩;另选取同期在本院进行健康产前检查的孕妇30例为对照组，年龄35～40岁，足月分娩。胎盘娩出后5min内，在胎盘不同区域剪取1cm×1cm胎盘组织，PBS漂洗后液氮中冻存。本研究经医院伦理委员会批准同意。

1.2纳入及排除标准

纳入标准:(1)符合《妇产科学》关于重度子痫前期诊断标准[5];(2)单胎;(3)所有研究对象知情且签署同意书。排除标准:(1)心、肝等器官疾病者;(2)精神疾病者;(3)妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病等妊娠相关合并症者;(4)免疫系统性疾病者;(5)凝血功能障碍性疾病者。

1.3材料与试剂

TRIzol试剂盒(美国Incitrogen公司);Nanodrop微量分光光度计、Qubit荧光定量仪(美国ThermoFisher公司);Agilent2100生物芯片分析系统(美国ThermoFisher公司);ribo-zero试剂盒、Illumina测序仪(美国Illumina公司);RNAFragmentationReagents(美国ABI公司);AgencourtRNACleanXP试剂盒(美国Beckman公司);Agilent2100Bioanalyzer(美国Agilent公司);cDNA合成委托上海欧易生物医学科技有限公司。

1.4方法

1.4.1组织样本RNA提取

取适量的胎盘组织样本用液氮充分研磨，采用TRIzol法提取不同组织中的总RNA;采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性、降解程度及是否被污染，采用微量分光光度计检测RNA纯度，采用荧光定量仪测定浓度;采用生物芯片分析系统检测RNA的纯度和完整性。

1.4.2lncRNA和mRNA基因芯片表达谱[6]

完成质检后，采用ribo-zero试剂盒消化核糖体RNA，加入RNAFragmentationReagents将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板，合成一链cDNA，并以dUTP代替dTTP合成二链cDNA，连接不同接头，再采用UNG酶法将含有dUTP一条链进行消化，只保留连接不同接头的cDNA一链并纯化，再进行末端修复、加多聚A尾并连接测序接头，然后选择片段大小，进行PCR扩增，质检合格后，进行测序。原始信号用分位数算法进行log2变换。lncRNA和mRNA差异表达的筛选条件为:基因表达值倍数变化(FC)的绝对值>2且P≤0.05。

1.4.3GO功能富集分析[7]

采用GO对差异表达lncRNA靶基因进行富集分析并绘图。GO功能注释对组织样本中差异表达的lncRNA靶基因进行功能分析，筛选差异表达基因富集的生物学功能。P<0.05为差异有统计学意义的信号通路条目。

1.4.4KEGG信号通路分析[7]

采用KEGG信号通路对差异表达lncRNA靶基因生物通路进行注释，筛选出与重度子痫相关的信号调控网络。P<0.05为差异有统计学意义的信号通路条目。

1.4.5靶基因PPI网络构建[8]

利用STRING数据库分析和Cytoscape软件构建靶基因PPI网络。将靶基因的蛋白质名称列表输入到STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)，选择物种为humanspecies，蛋白质相互作用评分>0.4且经实验验证，执行PPI网络分析。使用Cytoscape3.6.1软件绘制PPI网络，节点度≥10的蛋白质编码基因被设定为PPI中的核心基因。

1.4.6lncRNA-mRNA共表达分析[9]

通过结合芯片数据差异表达所得出的LncRNAs和mRNAs之间的表达相关性，并根据结果绘制了编码非编码基因共表达网络关系图(network)。选取与子痫前期发生可能相关性最显著的lncRNAs作为构建共表达网络关系图的核心基因，构建了共表达网络图。

1.5统计学分析

运用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料以(±s)表示，组间差异比较采用t检验和单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1lncRNA和mRNA表达分析

重度子痫胎盘差异lncRNA和mRNA表达热图见图1。与正常胎盘相比，重度子痫胎盘中筛选出差异表达lncRNA/mRNA共423个(FC>2,P<0.05)，其中8个显著上调，13个显著下调。见表1。

图1重度子痫胎盘差异lncRNA和mRNA表达谱

表1差异lncRNA/mRNA表达结果

2.2GO富集分析

差异lncRNA/mRNA表达GO结果显示:在生物学过程(BP)中主要富集在炎症反应、细胞因子分泌调控、干扰素γ分泌和调节、T辅助免疫应答调节、白细胞迁移黏附调控、T细胞活化迁移调控等条目中(图2A～图2B);在细胞组分(CC)中主要富集在细胞外基质、运输小泡、内质网-高尔基体等等条目中(图2C～图2D);在分子功能(MF)过程中主要富集在受体配体激活、生长因子结合、激素激活、细胞因子受体结合、转氨酶激活等条目中(图2E～图2F)。

2.3KEGG代谢通路分析

KEGGpathway代谢通路富集分析结果显示:差异表达的lncRNA主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、Ras信号通路、溶酶体、2-氧代羧酸代谢、氨基酸生物合成、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等中(图3A～图3B)。

图2差异表达lncRNA/mRNA的GO

图3KEGGpathway富集分析结果

2.4lncRNA-mRNA共表达网络构建

通过构建的lncRNA-mRNA共表达网络对本研究第1部分得到的差异表达LncRNAs数据筛选出15个比较可能有意义的lncRNAs，分别为趋化因子超家族(CXCL9、CX-CL10、CXCL11、CXCL12)及其受体(CXCR3)、趋化因子超家族配体家族(CCL13、CCL21)、G蛋白偶联因子超家族(CCR5)及其受体(GPR17、GPR183)、补体成分3a受体1(C3AR1)、甲酰肽受体3抗原(FPR3)、生长抑素基因(SST)、神经肽Y1受体(NPY1R)、嘌呤能受体(P2RY14)，与其余220个目标靶编码蛋白基因构建了一个编码-非编码基因共表达网络图。lncRNA-mRNA基因共表达网络见图4。

图4lncRNA-mRNA基因共表达网络

3、讨论

生物体内的RNA可分为具有编码蛋白质功能的mRNA和不具备编码能力的ncRNA，其中可编码蛋白的基因仅占人类基因的1%～2%,ncRNA占人类基因高达98%[10]。近年来，越来越多的研究表明，ncRNA在生物体内也具有重要的生物学功能，lncRNA是一类不编码任何蛋白质的ncRNA，与miRNA等其他ncRNA不同，lncRNA的分子链更长(超过200个核苷酸)，结构更复杂，可在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达，并广泛参与机体的生理病理过程，在肿瘤、心血管疾病及精神疾病等发生发展中扮演重要角色[11,12]。由于妊娠时的胎盘植入过程与肿瘤转移过程类似[13]，因此，鉴于lncRNA在肿瘤领域的研究进展，lncRNA在妊娠相关疾病方面的研究逐渐受到重视。

近年来研究[14]表明，lncRNA与多种不良妊娠结局的发生密切相关，但关于子痫前期中lncRNA的研究较少。本研究通过基因芯片对重度子痫患者胎盘和正常胎盘样本进行测序分析，揭示了lncRNA/mRNA在两种组织中的差异表达，成功建立了重度子痫胎盘相关的lncRNA差异表达谱，共筛选出21个显著差异表达的lncRNA(P<0.05)。对显著差异表达LncRNA的靶基因进行GO功能富集分析发现:在BP中主要富集在炎症反应、细胞因子分泌调控、干扰素γ分泌和调节、T辅助免疫应答调节、白细胞迁移黏附调控、T细胞活化迁移等条目中;在CC中主要富集在细胞外基质、运输小泡、内质网—高尔基体等等条目中;在MF过程中主要富集在受体配体激活、生长因子结合、激素激活、细胞因子受体结合、转氨酶激活等条目中;KEGGpathway代谢通路富集分析结果显示:差异表达的lncRNA主要富集在细胞因子-细胞因子受体、MAPK信号通路、Ras信号通路、溶酶体、2-氧代羧酸代谢、氨基酸生物合成、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等中。上述研究结果提示重度子痫与内皮细胞损伤、炎症反应、免疫调节功能异常、滋养细胞侵袭异常等有关，与文献[15]报道的子痫前期的病因学基本一致。

对靶基因进行PPI网络构建，共筛选出15个比较可能有意义的lncRNAs，分别为趋化因子超家族(CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12)及其受体(CXCR3)、趋化因子超家族配体家族(CCL13、CCL21)、G蛋白偶联因子超家族(CCR5)及其受体(GPR17、GPR183)、补体成分3a受体1(C3AR1)、甲酰肽受体3抗原(FPR3)、生长抑素基因(SST)、神经肽Y1受体(NPY1R)、嘌呤能受体(P2RY14)，提示差异表达lncRNA/mRNA与细胞生长、趋化等密切相关。

综上所述，重度子痫前期患者胎盘中差异表达的lncRNA可通过靶向调控其靶基因参与调控多种生物学功能级相关信号通路，在重度子痫前期发生发展过程发挥重要作用，预测的小分子lncRNA可作为临床治疗的参考依据。

参考文献：

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