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调更汤对去势SD大鼠下丘脑神经细胞损伤的保护作用

2020-10-13 245 上传者：管理员

摘要：目的:研究调更汤通过干预雌激素受体α,c-Jun氨基末端激酶,c-Jun蛋白改善去势5个月龄SD大鼠下丘脑神经细胞损伤的作用机制。方法:将40只4个月龄的SPF级SD雌性大鼠随机分为对照组、模型组、西药组、调更汤组。对照组行假手术处理,其余3组行双侧卵巢切除术,其中对照组与模型组给予生理盐水灌胃,西药组给予补佳乐(0.12mg•kg-1)灌胃,调更汤组给予中药调更汤[19.37g(生药)•kg-1]灌胃。Nissl染色法观察下丘脑神经细胞病理形态学改变;免疫荧光法检测ERα蛋白表达;免疫组织化学法检测JNK、磷酸化JNK(Phospho-c-JunN-terminalkinase,p-JNK)、c-Jun蛋白表达。结果:对照组下丘脑神经细胞结构清晰,尼氏体分布均匀,形态正常呈“虎斑”状,与对照组比较,模型组下丘脑尼氏体减少、肥大,染色变浅;模型组下丘脑组织中ERα蛋白表达显著减少(P<0.01),p-JNK、c-Jun蛋白表达显著增加(P<0.01)。调更汤干预后,与模型组比较,调更汤组尼氏体增多,形态正常,染色加深;ERα蛋白表达显著增多(P<0.01),p-JNK、c-Jun蛋白的表达显著降低(P<0.01)。结论:调更汤可能通过干预下丘脑组织中ERα、p-JNK、c-Jun蛋白起到神经保护的作用。

关键词：
下丘脑
妇产科
氨基末端激酶
绝经综合征
调更汤
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妇女在绝经期前后伴随月经紊乱或绝经出现的如烘热汗出、烦躁易怒、潮热面红、眩晕耳鸣、心悸失眠、腰背酸楚、面浮肢肿、皮肤蚁行样感、情志不宁等症状称为绝经前后诸症,亦称“经断前后诸症”[1]。西医定义为绝经综合征,是女性进入围绝经期后的常见病。据统计,预计到2030年我国围绝经期妇女将达到2.8亿,约90%的妇女将出现与绝经相关的症状[2],症状可持续到绝经后2～3年,甚至更长。绝经前后,卵巢功能逐渐衰退,体内雌激素水平逐渐下降,初期可表现为烘热汗出、情绪障碍、睡眠障碍、感觉异常等MS症状,后期表现为骨质疏松、代谢综合征、泌尿生殖道疾病及老年痴呆等[3,4]。西医治疗该病首选激素替代疗法能有效缓解绝经症状,预防绝经后骨质疏松。雌激素缺乏后尽早开始使用激素替代疗法可使女性获得雌激素对心血管的保护[2]。但长期应用存在禁忌证及不良反应,如心血管疾病、脑血管意外、子宫内膜病变、卵巢癌发病率增加等[5,6,7]。

调更汤由上海中医药大学附属曙光医院孙卓君教授研制,在临床上使用已超过30余年,是治疗MS的经验方,疗效可达88.87%[8,9]。笔者前期研究结果显示,调更汤可以增加大鼠卵巢超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活力,减少丙二醛(malondialdehyde,MDA)的产生,改善切除卵巢大鼠下丘脑氧化损伤,延缓下丘脑神经组织衰老,同时可调节下丘脑雌激素受体(estrogenreceptor,ER)系统,具有下丘脑神经保护作用[10]。亦能通过JNK通路改善低剂量三丁基锡(tributyltin-Chloride,TBTC)诱导的GT1-7下丘脑神经元细胞凋亡[11]。本实验拟在前期研究的基础上,以调更汤对下丘脑ERα膜受体效应介导的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedpoteinkinase,MAPK)级联通路作为切入点,以去势大鼠为模型,以JNK通路为核心,进一步探讨调更汤对下丘脑神经保护的可能机制,为中医药治疗MS提供实验依据。

1、材料与方法

1.1药物制备

调更汤方药组成:知母9g,黄柏9g,柴胡9g,白芍10g,生地黄15g,淫羊藿15g,巴戟天9g,生龙骨30g,生牡蛎30g,首乌藤30g。生药含量166g·L-1,成人剂量标准2.77g·kg-1(大鼠剂量是成人的7倍)由四川新绿色药业科技发展有限公司提供,批号:91510000684559613P。

1.2实验试剂

BSA(德国Biofroxx公司,批号:4240GR100),抗体一抗p-JNK,c-Jun(美国CST公司,批号分别为:4668、2527),一抗JNK(美国R&DSystems公司,批号:AF1387),一抗ERα(美国abcam公司,批号:ab32063),Nissl染色液,DAPI染色液,免疫荧光染色试剂盒-抗兔AlexaFlour488(碧云天生物技术有限公司,批号分别为:C0117、C1006、P0176),即用型免疫组织化学试剂盒I(上海齐正生物科技有限公司,批号:Q3295)。

1.3实验仪器

BSA124S型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司),DNP-9052型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),NikonH550S型正置显微镜,Ti-E型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。

1.4实验方法

1.4.1模型制备与分组

SPF级4个月龄雌性SpragueDawley大鼠40只,体质量为(360±50)g,由上海中医药大学SPF级动物实验中心提供并饲养,合格证号:SCXK(上海)2013-0016。在标准实验条件下,12h昼夜循环,恒温25℃,自由进食水。本次动物实验获得上海中医药大学动物伦理委员会(许可证号:2012014)评估和批准,所有处理尽量减轻动物的痛苦。大鼠随机分为4组,每组10只。其中3组进行双侧卵巢切除术,分为模型组,西药组及调更汤组;另外1组行假手术(未切除卵巢)作为对照组。对照组及模型组每日给予生理盐水2mL灌胃,西药组每日给予补佳乐0.12mg·kg-1灌胃,调更汤组每日给予调更汤19.37g·kg-1灌胃。处理4周后,使用30g·L-1戊巴比妥钠麻醉,对所有大鼠实施安乐死,取下丘脑组织进行研究。

1.4.2Nissl染色法观察下丘脑神经细胞病理形态学改变

取下丘脑组织进行常规固定、包埋、切片、脱蜡、水化等处理,使用尼氏染色液进行染色10min,之后经脱水透明、中性树胶封片固定。染色切片在倒置荧光显微镜下放大600倍下,随机选取10个视野进行拍照观察。

1.4.3免疫荧光法检测下丘脑组织中ERα蛋白表达

取下丘脑组织,固定样品,制备冰冻切片。按照荧光免疫染色常规方法进行操作,3%BSA封闭30min,一抗ERα抗体(1:200)4℃孵育过夜,0.3%PBST洗片,荧光二抗(1:1000)室温避光孵育1h,洗片,DAPI染核,洗片,封片。倒置荧光显微镜下观察,拍照,并使用软件ImageJ分析图像,统计每个视野的平均光密度值。

1.4.4免疫组织化学法检测下丘脑组织中JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达

取下丘脑组织进行常规固定、包埋、切片、脱蜡、水化等处理,H2O2消除内源性过氧化物酶,微波修复抗原,3%BSA封闭30min,滴加JNK(1:50)、p-JNK(1:200)、c-Jun(1:160)抗体,4℃冰箱孵育过夜,0.3%PBST冲洗后加入二抗孵育30min,经DAB显色后,苏木素复染,中性树胶封片。染色的切片在正置显微镜放大200倍视野下,有棕黄色颗粒沉着,随机选取6个视野进行拍照,并使用软件ImageProPlus分析图像,分析每个视野的阳性OD值进行统计。

1.5统计学方法

采用SPSS21.0软件对所得数据进行统计处理,数据以均数±标准差(x±s)表示。若数据符合方差齐性要求,各组间差异采用单因素方差分析;若方差不齐,组间比较采用DunnettT检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠下丘脑神经细胞病理形态比较

对照组神经细胞结构清晰,尼氏体分布均匀,形态正常呈“虎斑”状,模型组下丘脑尼氏体减少、肥大,染色变浅。与模型组相比较,西药组及中药组尼氏体增多,形态正常,染色加深。见图1。

图1各组大鼠下丘脑神经细胞病理形态比较(Nissl,×600)

2.2各组大鼠下丘脑ERα蛋白表达比较

与对照组比较,模型组ERα蛋白荧光表达显著减少(P<0.01);与模型组比较,西药组及调更汤组ERα蛋白荧光表达显著增加(P<0.01)。见图2,表1。

图2各组SD大鼠下丘脑ERα蛋白荧光表达情况(免疫荧光,×200)

表1各组大鼠下丘脑ERα蛋白表达比较(x±s)

2.3各组大鼠下丘脑JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达比较

与对照组比较,模型组下丘脑p-JNK、c-Jun蛋白阳性表达率显著增加(P<0.01)。与模型组比较,西药组及调更汤组下丘脑p-JNK、c-Jun蛋白阳性表达率显著降低(P<0.01)。见表2,图3。

表2各组大鼠下丘脑JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达比较(x±s)

图3各组大鼠下丘脑JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达比较(免疫组织化学,×200)

3、讨论

中医将MS归属于“脏躁”“百合病”等范畴。中医以“经水出诸肾”“七七任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子”为理论基础,认为女子七七绝经之际,肾-天癸-冲任-胞宫生殖轴日渐衰老,肾精亏虚无以濡养脏腑,以致阴阳失衡,脏腑功能失调,导致诸多绝经前后症状。西医认为,女性卵巢衰老、功能衰退导致体内雌激素急剧下降或波动,引起下丘脑-垂体-卵巢-子宫生殖轴功能紊乱,内分泌、神经递质、免疫等环节失调而产生一系列绝经相关症状。中医和西医对于MS发病机理的共识在于:本病的核心在于生殖轴衰老过程中出现的调节功能失常。调更汤由经方桂枝加龙骨牡蛎汤化裁而来,本方由医圣张仲景所创,出自《金匮要略》,言:“夫失精家,少腹弦急,阴头寒,目眩发落……桂枝加龙骨牡蛎汤主之。”本方以阴阳两虚为机制,阴泻阳浮所致小腹弦急疼痛、头部阴冷不适、目眩神昏为其辨证要点。后世医家多以此方来治疗经断前后诸症等[12]。调更汤以调补肝肾、燮理阴阳为治疗大法,兼顾活血化瘀、理气祛痰。方以生地黄、白芍为君药。生地黄苦寒入肾,清热除烦;白芍酸敛入肝,养肝血而补肝体,肝肾同源,精血互生,两者相须为用,具有补肾益精、滋阴生津、养血柔肝的功效。淫羊藿、巴戟天为臣药,二药合用在本方中取“阳中求阴”之意,善补阴者,必于阳中求阴,则阴得阳升而泉源不竭。知母、黄柏、龙骨、牡蛎、首乌藤为佐药,巴戟天配知母、黄柏增强了补阴生津之效,减轻了温热之性;龙骨与牡蛎均有平肝潜阳、镇惊安神之效;首乌藤养心安神、补益阴血。柴胡为使药,有疏肝解郁、升举阳气之效。诸药配伍,标本同治,有良好的临床治疗效果[13]。本研究中,调更汤对切除双侧卵巢的SD大鼠下丘脑神经组织有保护作用。切除双侧卵巢的大鼠经阴道涂片7d,见持续动情间期确定造模成功[14]。尼氏体是神经元的特征性结构之一,是神经元合成蛋白的主要场所,当神经元受到损伤时,尼氏体可减少、解体甚至消失,在损伤恢复过程中,尼氏体又重新出现、增多,并可至正常水平[15]。故尼氏体可作为神经元功能状态的标志。本实验中,Nissl染色法可发现,模型组下丘脑尼氏体减少、肥大,染色变浅。与模型组比较,西药组及中药组尼氏体增多,形态正常,染色加深。说明调更汤对下丘脑神经组织有保护作用。

绝经期卵巢卵泡耗竭,雌激素水平骤降,从而导致一系列绝经相关的症状。雌激素通过与ER结合发挥其生物学功能,包括经典的核受体(nER)和膜受体(mER)途径。ERα是经典的核受体之一,可分布在细胞核及细胞膜上,膜定位的ER可能是经典nER的变体[16]。研究表明,ERα发挥核受体和膜受体两种生物效应[17],并且在下丘脑多个神经细胞核区显示其膜受体的作用[18],介导17β-雌二醇激活MAPK级联等多条细胞内信号传导通路[17,18],影响下丘脑功能。雌激素对于下丘脑神经功能的调节,对治疗MS有重要作用。前期研究发现,雌激素和调更汤均对下丘脑ERα有调节作用[10]。本次免疫荧光实验再次验证了调更汤可调节下丘脑ERα,且蛋白定位于细胞膜上。在MAPK通路中,雌激素与ER结合后激活级联反应,能够促进神经细胞分化、再生及突触形成[19]。雌二醇与ER结合后可调节JNK信号通路,激活c-Jun,减弱JNK信号通路的促细胞凋亡作用来达到保护神经组织的作用[20]。膜受体可通过MAPK级联通路,影响和调节核受体,雌激素可上调转录因子激活蛋白1,该蛋白诱导c-Jun基因,而c-Jun基因是已知的核受体作用调节剂[21]。本次免疫组织化学实验的结果发现,调更汤可显著降低磷酸化JNK及c-Jun蛋白水平,说明调更汤对下丘脑神经组织的保护作用可能与调节ERα蛋白从而抑制磷酸化JNK及c-Jun蛋白表达有关。

综上,调更汤对去势SD大鼠下丘脑具有神经保护作用,经调更汤治疗后,去势SD大鼠下丘脑组织中ERα蛋白表达显著增加,p-JNK、c-Jun蛋白表达显著降低。以上提示,调更汤可能通过上调ERα膜受体效应,抑制JNK磷酸化,降低c-Jun蛋白水平起到保护下丘脑神经的作用。

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