绝经后骨质疏松症是一种发生于绝经后妇女且与衰老有关的全身代谢性疾病，主要因卵巢功能减退、雌激素分泌不足，出现低骨量及骨组织结构变化，增加骨脆性和骨折发生风险，具有发病率、致残率及致死率高的特点[1,2,3]。研究表明，绝经后骨质疏松症主要因骨形成与骨吸收失衡引起，其发生与MAPK信号通路调节破骨细胞代谢密切相关[4,5,6]。目前，临床上治疗绝经后骨质疏松症所使用的改善骨代谢的药物长期服用后不良反应发生率较高，而槲皮素多以甙的形式存在于许多植物的花、叶、果实中，具有安全性高、不良反应少等优点[7]。研究指出，槲皮素在骨质疏松症的治疗中发挥重要作用，可抑制压力诱导早熟型衰老水平，降低衰老相关分泌表型表达[8]。所以，本研究旨在分析槲皮素对绝经后骨质疏松大鼠模型骨形成的影响并初步分析其作用机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：

SPF级SD雌性大鼠60只，体质量180～220 g,购自齐鲁制药有限公司，动物生产许可证号为SYXK(鲁) 20210014,合格证号为37009200009757。大鼠于温度20℃～24℃、湿度50 %～70 %、12 h光照/黑暗周期交替的环境中适应性喂养1周，期间饮食饮水自由。动物实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准(JZLLSC20220337)。

1.1.2主要药物和试剂：

HE染色试剂盒(深圳塞尔玛生物技术有限公司);4 %多聚甲醛(上海博古生物有限公司);雌激素雌二醇(estradiol, E2)、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC、IL-6、TNF-α、IL-1βELISA试剂盒(四川迈克生物科技股份有限公司);一抗、二抗(英国Abcam公司)。

1.1.3实验仪器：

恒温干燥箱、粘附载玻片、盖玻片(德国Memmert公司);光学显微镜、石蜡切片、组织包埋机、自动脱水机(德国Leica公司)、显微CT扫描仪(德国Siemens公司)。

1.2方法

1.2.1造模方法：

通过切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松大鼠模型：腹腔注射2 %戊巴比妥钠3 mL/kg,并分别在脊柱两侧约1 cm左右作纵行切口，切开腹膜进入腹腔，切除双侧卵巢。

1.2.2分组：

造模、喂药及饲养过程中死亡10只，余50只。将50只SPF级SD雌性大鼠分为假手术组、模型组、槲皮素低、高剂量组及补佳乐组，各10只。假手术组大鼠仅切除双侧卵巢周围等量体积脂肪：在双侧卵巢周围切除等量体积脂肪，逐层缝合，碘伏消毒，注射青霉素预防感染。

1.2.3给药：

建模3 d后进行药物干预，槲皮素低剂量组采用槲皮素100 mg/kg灌胃，槲皮素高剂量组采用槲皮素200 mg/kg灌胃，补佳乐组采用补佳乐(戊酸雌二醇片)0.09 mg/kg灌胃，假手术组及模型组灌胃等体积生理盐水，1次/d,给药4周[9]。

1.2.4 ELISA法检测血清E2、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC、IL-6、TNF-α、白介素IL-1β水平：

经腹主动脉采血约8 mL,室温静置3 h,离心20 min,转速4 000 r/min,分离血清，采用ELISA试剂盒检测血清CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC、IL-6、TNF-α、IL-1β、E2水平。

1.2.5 HE染色观察骨组织形态学变化：

大鼠药物干预完成后颈椎脱臼处死，解剖其单侧股骨，取骨组织，10 %甲醛固定，添加10 %乙二胺四乙酸二钠脱钙处理5周，常规处理，石蜡包埋，制作5μm石蜡切片。HE染色后，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.6 TRAP染色观察骨表面的破骨细胞数量：

股骨石蜡切片于60℃下烤片1.5 h,脱蜡至水，放置在37℃预热染料液中浸泡，水洗，染色1 min,梯度乙醇脱水，二甲苯净化，中性树胶封片，镜下观察。通过Image-Pro plus 6.0软件分析破骨细胞数量(number of osteoclasts per bone surface, N.Oc/BS)。

1.2.7显微CT扫描测定股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁间距：

取大鼠另一侧股骨，10 %甲醛固定24 h,存于70 %乙醇溶液，通过Micro-CT影像系统扫描，观察大鼠股骨骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁间距(trabecular separation, Tb.Sp)变化。

1.2.8 WB检测MAPK信号通路相关蛋白表达：

取部分股骨组织置于液氮中研磨，裂解，样品12 000 g离心5 min,取上清，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜。5 %脱脂牛奶室温封闭1 h,加兔抗人RANKL(1∶500)、p-JNK/JNK(1∶1 000)、p-ERK1/2/ERK1/2(1∶1 000)、p-p38/p38(1∶1 000),4℃过夜，TBST洗3次，10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000),室温孵育1 h, TBST洗3次，每次10 min。化学发光成像系统进行可视化和数据分析。GAPDH(1∶1 000)为上样量对照。

1.3统计学分析

采用统计学软件SPSS 21.0来处理实验数据，用均值±标准差的形式记录实验数据，采用单因素分析及LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。[LL]

2、结果

2.1各组大鼠血清E2水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠血清E2水平降低(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠血清E2水平增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠血清E2水平增加(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠血清E2水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1各组大鼠血清E2水平比较

2.2各组大鼠血清骨代谢标志物水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠血清骨代谢标志物水平降低(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠血清骨代谢标志物水平增加(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠血清骨代谢标志物水平增加(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠血清骨代谢标志物水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2各组大鼠血清骨代谢标志物水平比较

2.3各组大鼠血清炎性指标水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠血清炎性指标水平增加(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠血清炎性指标水平降低(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠血清炎性指标水平降低(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠血清炎性指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3各组大鼠血清炎性指标水平比较

2.4骨组织形态学变化

假手术组骨组织结构清晰完整，形态正常，呈网状交织排列；模型组骨皮质厚度变薄，骨小梁数量减少且断裂，排列稀疏；槲皮素低、高剂量组及补佳乐组出现新生骨小梁，数量增加，骨组织形态、结构相对完整、清晰。详见图1。

图1骨组织形态学变化(40×)  

2.5大鼠N.Oc/BS比较

与假手术组相比，模型组大鼠N.Oc/BS增加(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠N.Oc/BS降低(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠N.Oc/BS差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

图2大鼠N.Oc/BS(200×)   

2.6股骨BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比较

与假手术组相比，模型组大鼠BMD、Tb.N、Tb.Th降低，Tb.Sp增大(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组大鼠BMD、Tb.N、Tb.Th增高，Tb.Sp减小(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠BMD、Tb.N、Tb.Th增高，Tb.Sp减小(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠股骨BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4股骨BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp比较

2.7 MAPK信号通路相关蛋白表达

与假手术组相比，模型组MAPK信号通路相关蛋白水平增加(P<0.05);与模型组相比，槲皮素低、高剂量组及补佳乐组MAPK信号通路相关蛋白水平降低(P<0.05);与槲皮素低剂量组相比，高剂量组及补佳乐组大鼠MAPK信号通路相关蛋白水平降低(P<0.05);槲皮素高剂量组与补佳乐组大鼠MAPK信号通路相关蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。详见表5。

表5 MAPK信号通路相关蛋白表达

3、讨论

骨是通过有机基质矿化连续形成的更新组织，成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收平衡被破坏会导致骨质疏松症等骨病。绝经后骨质疏松症是一种常见的骨质疏松疾病[10]。槲皮素在自然界中广泛存在，是一种具有许多药理活性的类黄酮，可消除自由基、抗病毒、保护心血管[11]。研究显示，槲皮素被证实能够有效清除衰老的骨髓间充质干细胞，并通过雌激素受体介导的通路促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨向分化，从而改善骨组织结构及功能[12]。因此，本研究旨在通过对绝经后骨质疏松大鼠模型进行深入研究，了解槲皮素对骨形成的影响及其潜在机制，期望能为绝经后骨质疏松症的治疗提供新的思路和理论基础。

本研究通过HE染色后发现，模型组骨皮质厚度变薄，骨小梁数量减少且断裂，排列稀疏，血清E2下降，提示建模成功，经槲皮素干预后，骨小梁数量增加，骨组织形态、结构相对完整、清晰。骨代谢是一个复杂的生理过程，通过成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用来维持骨骼的动态平衡。成骨细胞是主要的骨形成细胞，负责合成和分泌骨基质，并参与骨组织的形成和发育。破骨细胞是一种特殊的骨细胞，主要负责骨组织的吸收[13]。PICP是一种由成骨细胞合成并释放到血液中的胶原蛋白片段，它的血清水平能够反映Ⅰ型胶原的合成速率，是骨骼健康和骨转换状态的重要检测指标[14]。通过ELISA法检测血清学指标发现，模型组大鼠血清E2、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平降低；而经槲皮素干预后，E2、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平增加，这提示槲皮素能够缓解雌激素下降速度，改善机体骨代谢相关指标高转换的状态[15],骨代谢指标CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平上升提示槲皮素能够改善骨代谢失衡，稳定骨代谢平衡[16]。破骨细胞生成及骨吸收过多均会影响骨组织及骨微结构，增加骨折风险，通过TRAP染色观察骨表面的N.Oc/BS发现，槲皮素干预组大鼠N.Oc/BS降低，显微CT扫描可观察骨微结构[17],本研究发现，经槲皮素干预后大鼠BMD、Tb.N、Tb.Th增高，Tb.Sp减小，这都表明槲皮素能够抑制破骨细胞的生成，缓解绝经后骨质疏松大鼠骨代谢失衡及骨微结构破坏。

在骨代谢过程中，RANK和RANKL起到了关键作用，RANK是破骨细胞表面的受体，而RANKL则是RANK的配体，当RANK与RANKL结合后，会诱导破骨细胞的分化。此外，RANK与RANKL的结合还能激活MAPKs信号通路。MAPKs是一组在细胞内信号传递中发挥重要作用的蛋白激酶，能够将外部信号传递到细胞核内，调控基因的表达。在骨吸收过程中，MAPKs信号通路的激活能够实现骨吸收的功能。同时，TNF-α、IL-6或IL-1等炎性介质也可以激活MAPK信号通路，进一步促进破骨细胞的分化、增殖和成熟。研究指出，MAPK信号通路可能作用于成骨细胞分化和骨形成从而参与绝经后骨质疏松症的发生发展[18]。绝经后骨质疏松症的发生发展与机体免疫微环境中炎症状态密切相关，包括IL-6、TNF-α、IL-1β在内的促炎因子与骨代谢的状态变化密切相关，其水平增加会影响RANKL的表达。NF-κB、MAPK信号通路的激活与RANKL表达水平升高密切相关，RANKL表达水平升高会影响NF-κB、MAPK信号通路从而调节破骨细胞的骨吸收作用[19]。文献指出，RANKL受影响后会发生磷酸化并激活ERK、p38、JNK三类MAPK,抑制ERK1/2、p38 MAPK、JNK可有效减少破骨细胞成熟和骨吸收[20]。ELISA及WB实验发现，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平增加，RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白水平升高，而在应用槲皮素干预后，大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38蛋白水平降低，提示槲皮素可以降低促炎因子的表达水平，抑制RANKL表达从而调控MAPK信号通路的活化，减少相关蛋白p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表达水平，减少破骨细胞的分化增殖，对绝经后骨质疏松症患者起到保护作用。

综上所述，槲皮素能够通过调节绝经后骨质疏松大鼠雌激素水平，改善骨代谢异常，缓解骨微结构变化，对骨质疏松具有保护作用。可能是通过抑制MAPK信号通路相关蛋白表达、减少破骨细胞形成、减少骨吸收来实现的。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(82274544);江西省中医药管理局科技计划项目(2023B0280);广州市科技计划项目(202206010184); 2021年广东省教育厅普通高校重点领域专项(2021ZDZX2005);

文章来源:康庐琛,魏秋实,李文斌,等.槲皮素调控MAPK通路对绝经后骨质疏松大鼠骨形成的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(05):625-630.