多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是育龄妇女最常见的内分泌异常疾病，总患病率为8%～15%，通常与女性不孕症、月经不规律、排卵功能障碍及妊娠并发症有关，还涉及胰岛素抵抗、代谢综合征和抑郁症的代谢紊乱等[1]。然而，PCOS具体的发病机制和病因尚不清楚。卵巢颗粒细胞为卵母细胞的发育提供营养和生长调节剂，在卵泡发育和排卵过程中起着至关重要的作用。颗粒细胞凋亡会导致卵泡闭锁，引起卵巢变性，进而引发PCOS[2]。因此，PCOS的发病与颗粒细胞增殖和凋亡的失调密切相关。

Hippo信号通路是一条以YES相关蛋白（YES asso‐ciated protein,YAP）为下游效应器的激酶通路，能参与调节卵泡发育的所有阶段。研究发现，该信号通路可介导卵巢颗粒细胞自噬和凋亡，调节卵泡发育[3]。既往研究显示，石斛汤可提高PCOS患者的妊娠率[4,5]，而毛兰素（erianin,ERI）是石斛的主要活性成分之一。鉴于此，本研究通过构建PCOS大鼠模型，探究了ERI对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响，并基于Hippo-YAP信号通路初步探讨了其作用机制，以期为PCOS的治疗提供新的方向。

1、材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括Axio Observer A1型显微镜（德国Zeiss公司），罗氏®ACCU-CHEK血糖仪[罗氏诊断产品（上海）有限公司]，x Mark酶标仪（美国Bio-Rad公司），MultifugeTM X1/X1R Pro离心机、E-Gel Imager凝胶成像系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要药品与试剂

ERI对照品（纯度≥98%，批号SE8460）购自北京索莱宝科技有限公司；脱氢表雄酮（dehydroepiandros‐terone,DHEA）对照品（纯度99%，批号D106380）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；维替泊芬对照品（YAP抑制剂，纯度99.26%，批号HY-B0146）购自美国MCE公司；雌二醇（estradiol,E2）、黄体生成素（luteinizing hormone,LH）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号分别为BAS16134、BAS16165）均购自上海羽哚生物科技有限公司；卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）、睾酮（testosterone,T)ELISA试剂盒和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G二抗（批号分别为SBJ-R0049、SBJ-R0723、BI-WB021）均购自南京森贝伽生物科技有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号abs9217）购自上海爱必信生物科技有限公司；TUNEL染色试剂盒（批号C11026-1）购自广州锐博生物科技有限公司；兔源B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、转录共激活子因子PDZ结合基序（transcriptional co-activator with PDZ binding motif,TAZ）多克隆抗体和兔源Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）、胱天蛋白酶3(Cas‐pase-3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos‐phate dehydrogenase,GAPDH）单克隆抗体（批号分别为ab196495、ab176396、ab32503、ab184787、ab181602）均购自英国Abcam公司；兔源大肿瘤抑制激酶1(large tumor suppressor kinase 1,LATS1）、磷酸化LATS1(phosphory‐lated LATS1,p-LATS1）、YAP、磷酸化YAP(phosphory‐lated YAP,p-YAP）单克隆抗体（批号分别为3477、8654、4912、4911）均购自美国CST公司。

1.3 实验动物

雌性SD大鼠65只，SPF级，8周龄，体重180～220g，购自青岛隆和生物科技有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）2021-0002。大鼠饲养于温度（20±3）℃、相对湿度45%～65%的笼中，光照12 h/黑暗12 h循环，均自由饮食。

2、方法

2.1 PCOS大鼠模型制备

取50只大鼠，参照已有研究方法诱导PCOS大鼠模型：皮下注射DHEA（按每100 g体重给予6 mg DHEA，溶于0.2 m L注射油），每日1次，连续21 d[6]。造模大鼠阴道涂片持续以白细胞为主，血清E2水平显著下降，T、LH水平和LH/FSH显著增高，且经病理观察发现卵巢组织呈多囊性改变，即可确定PCOS大鼠诱导成功。本研究造模过程中没有大鼠死亡。另随机选取10只正常大鼠作为正常组，以0.2 m L/d皮下注射与PCOS大鼠相同剂量的注射油。

2.2 大鼠分组与给药

将造模成功的PCOS大鼠随机分为PCOS组、ERI低剂量组、ERI中剂量组、ERI高剂量组和ERI高剂量+维替泊芬组，每组10只。给药前，各组大鼠先称重，然后ERI低、中、高剂量组大鼠根据相关文献[7]和前期预实验结果分别灌胃10、20、40 mg/kg的ERI（用1%二甲基亚砜溶解）；ERI高剂量+维替泊芬组大鼠灌胃40 mg/kg的ERI，同时腹腔注射10 mg/kg的维替泊芬[8];PCOS组和正常组大鼠灌胃等体积的1%二甲基亚砜。大鼠每日给药1次，连续6周。

2.3 大鼠体重和空腹血糖水平检测

给药结束后，各组大鼠禁食12 h后称重，尾静脉采血，测定空腹血糖（fasting blood glucose,FPG）水平。

2.4 大鼠性激素水平检测

FPG水平检测完成后，麻醉大鼠，腹主动脉采血，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中E2、T、FSH、LH水平，并计算LH/FSH。然后将大鼠安乐死，收集其卵巢组织，将部分卵巢组织固定在4%的多聚甲醛溶液中24 h，剩余的卵巢组织保存在-80°C条件下，用于后续实验。

2.5 大鼠卵巢组织形态学变化观察

取4%多聚甲醛溶液中固定的卵巢组织，以石蜡包埋，切片，HE染色10 min，经漂洗、脱水后封片，在显微镜下观察各组大鼠卵巢组织的形态学变化，并计数随机5个视野内的囊性卵泡和黄体数量。

2.6 大鼠卵巢组织细胞凋亡情况分析

将卵巢组织切片脱蜡、水化，以蛋白酶K处理，加入TUNEL反应液，于37℃孵育60 min，然后加入以辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体，于37℃孵育30 min，用二氨基联苯胺对载玻片进行染色后再用苏木精复染，在显微镜下观察各组大鼠卵巢组织细胞凋亡情况（标记为绿色的细胞），并计算细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.7 大鼠卵巢组织中凋亡和Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达检测

取各组大鼠冻存的卵巢组织，提取总蛋白，在RIPA缓冲液中裂解，使用BCA试剂盒定量蛋白质浓度，变性后电泳分离，转移到硝化纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭；加入Bax、Bcl-2、Caspase-3、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP、TAZ一抗（稀释比例均为1∶1 000）和GAPDH（稀释比例为1∶5 000），在4℃下孵育过夜，然后加入二抗（稀释比例为1∶5 000），孵育1 h，以ECL显影；用Image J软件量化条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示蛋白的表达水平。

2.8 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 ERI对大鼠体重和FPG水平的影响

与正常组比较，PCOS组大鼠给药前体重和给药后体重、FPG水平均显著升高（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组大鼠给药后体重、FPG水平均显著降低（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组大鼠给药后体重、FPG水平均显著升高（P<0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠体重和FPG水平比较（,n=10) 

3.2 ERI对大鼠性激素水平的影响

与正常组比较，PCOS组大鼠血清中E2水平显著降低，T、LH水平和LH/FSH均显著升高（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组大鼠血清中E2水平均显著升高，T、LH水平和LH/FSH均显著降低（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组大鼠血清中E2水平显著降低，T、LH水平和LH/FSH均显著升高（P<0.05）。结果见表2。  

表2 各组大鼠性激素水平比较（,n=10) 

3.3 ERI对大鼠卵巢组织形态学变化的影响

正常组大鼠卵巢颗粒细胞完整且排列规律，可见不同阶段的卵泡、成熟卵母细胞和黄体。与正常组比较，PCOS组大鼠卵巢呈多囊特征改变，可见严重闭锁性卵泡和少量成熟卵泡及颗粒细胞层，囊性卵泡数量增加，黄体数量减少（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组大鼠卵巢多囊特征减轻，闭锁性卵泡数量减少，颗粒细胞层增厚和聚集，囊性卵泡数量减少，黄体数量增多（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组大鼠卵巢呈多囊特征改变，伴黄体、颗粒细胞层减少和卵泡闭锁，囊性卵泡数量增加，黄体数量减少（P<0.05）。结果见图1、表3。

图1 各组大鼠卵巢组织HE染色图  

表3 各组大鼠卵巢组织中囊性卵泡和黄体数量比较（,n=10，个） 

3.4 ERI对大鼠卵巢组织细胞凋亡的影响

与正常组[（5.83±0.46）%]比较，PCOS组[（18.53±1.92）%]大鼠卵巢组织细胞凋亡指数显著升高（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组卵巢组织细胞凋亡指数[（15.73±1.64）%、（11.26±1.38）%、（8.69±0.93）%]均显著降低（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组[（16.49±1.72）%]大鼠卵巢组织细胞凋亡指数显著升高（P<0.05）。结果见图2。

图2 各组大鼠卵巢组织TUNEL染色图   

3.5 ERI对大鼠卵巢组织中凋亡相关蛋白表达的影响

与正常组比较，PCOS组大鼠卵巢组织中Bax、Cas‐pase-3蛋白表达水平均显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组大鼠卵巢组织中Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结果见图3、表4。

图3 各组大鼠卵巢组织中凋亡相关蛋白表达的电泳图  

3.6 ERI对大鼠卵巢组织中Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组比较，PCOS组大鼠卵巢组织中p-LATS1、p-YAP蛋白表达水平均显著升高，LATS1、YAP、TAZ蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）；与PCOS组比较，ERI低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中p-LATS1、p-YAP蛋白表达水平均显著降低，LATS1、YAP、TAZ蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与ERI高剂量组比较，ERI高剂量+维替泊芬组大鼠卵巢组织中p-LATS1、p-YAP蛋白表达水平均显著升高，LATS1、YAP、TAZ蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见图4、表5。  

表4 各组大鼠卵巢组织中凋亡相关蛋白表达水平比较（,n=10)  

图4 各组大鼠卵巢组织中Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达的电泳图     

表5 各组大鼠卵巢组织中Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达水平比较（,n=10) 

4、讨论

DHEA刺激大鼠模型表现出与人类PCOS相似的卵巢、内分泌和代谢特征，如多囊卵巢、雄激素过多和葡萄糖耐受不良，被广泛应用于PCOS的研究[9]。已有研究表明，T水平升高表明雄激素的过度表达，可导致循环高雄激素血症和激素失衡，进而引发PCOS和体重增加；下丘脑-垂体-性腺轴在调节生殖功能和高雄激素血症中起着至关重要的作用，PCOS大鼠表现出LH水平和LH/FSH升高，这表明下丘脑-垂体-性腺轴被破坏，出现了卵巢生理异常；E2水平降低与发情周期异常和多发性囊肿形成有关[10]。本研究采用DHEA诱导PCOS大鼠模型，并使用低、中、高剂量的ERI进行干预后发现，PCOS大鼠的卵巢多囊特征减轻，闭锁卵泡数量减少，颗粒细胞层增厚，体重、FPG水平、T水平、LH水平、LH/FSH下降，E2水平升高，这提示ERI能够改善PCOS大鼠肥胖，调节性激素水平，减少卵巢组织的多囊特征改变。

颗粒细胞是卵巢的主要组成部分，其凋亡是PCOS卵巢储备功能减弱的原因。Bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因，Bax是促凋亡基因[11]。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，对染色质凝聚、DNA断裂、细胞核和细胞膜空泡化至关重要，并与凋亡小体的形成过程有关[12]。ERI已被发现能够通过抑制Caspase-3上调和Bax/Bcl-2平衡中断等途径引发细胞凋亡，进而改善葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞损伤[13]。本研究结果发现，经低、中、高剂量ERI干预后的PCOS大鼠的卵巢组织细胞凋亡减少，细胞凋亡指数和Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显著降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，这提示ERI能通过减少卵巢组织细胞凋亡，改善大鼠PCOS。由于颗粒细胞是影响卵泡发育的关键因素之一，且是组成卵泡的最大细胞群，而卵泡的数量和质量直接影响卵巢的生命力，故本研究推测卵巢组织中凋亡的细胞为颗粒细胞，后期将对颗粒细胞进行特异性标记，进而确定凋亡的细胞类型。

Hippo信号通路通过调节细胞增殖和凋亡来控制器官发育。Hippo信号通路激活导致YAP/TAZ复合物磷酸化，使其滞留在细胞质中并最终降解，致使生长促进基因表达减少，细胞增殖和器官发育被抑制[5]。已有研究显示，激活Hippo-YAP信号通路，可导致雌性小鼠生育能力降低[14]。本研究结果发现，经低、中、高剂量ERI干预后，PCOS大鼠卵巢组织中p-LATS1、p-YAP蛋白表达水平均显著降低，LATS1、YAP、TAZ蛋白表达水平均显著升高，这提示ERI能抑制Hippo-YAP信号通路激活，促进卵巢颗粒细胞增殖。为进一步探究ERI通过调节Hippo-YAP信号通路在PCOS中的作用，本研究在高剂量ERI干预的基础上使用YAP抑制剂维替泊芬处理PCOS大鼠，发现ERI对PCOS大鼠性激素水平、卵巢组织形态学及细胞凋亡的调节和改善作用被抑制。这进一步验证了ERI可能通过抑制Hippo-YAP信号通路在PCOS中发挥改善作用。

综上所述，ERI能促进PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖，调节性激素水平，其作用机制可能与抑制HippoYAP信号通路有关。

参考文献:

[4]张聪敏,韩长月.石斛汤治疗多囊卵巢综合征不孕症疗效观察[J].辽宁中医杂志,2013,40(11):2290-2292.

[5]张聪敏,韩长月.石斛汤联合促排卵药治疗多囊卵巢综合征不孕症的临床观察[J].河北中医,2013,35(12):1817-1819.

[6]白雪,于月新,郑春杨,等. miR-296-3p调节多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞凋亡的作用机制[J].中国生物工程杂志,2023,43(4):20-29.

[7]龚宇,杨文健,李鸣一.毛兰素通过JNK/c-Jun信号通路对2型糖尿病大鼠肝脏损伤的保护作用机制研究[J].安徽医药,2023,27(4):663-668,849.

基金资助:河北省医学科学研究课题(No.20241284);承德市科技计划自筹经费项目(No.202204A006);

文章来源:房丽娜,李妍仪,董超,等.毛兰素对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及机制[J].中国药房,2024,35(11):1339-1344.