宫颈癌又称为子宫颈癌，是发生在子宫颈部位的女性生殖道恶性肿瘤，作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，早期治愈率高但早期症状不明显或没有症状，导致患者确诊时大多已进展到中晚期或已发生转移，因此，其临床总体治愈效果并不理想，患者死亡率很高[1-2]。研究证明微小RNA与癌症的发生及进展关系密切，微小RNA-585-5p(miR-585-5p）在预测癌症患者不良预后方面表现出良好的性能，其异常低表达与宫颈癌症患者的极低生存率相关，且miR-585-5p作为一种关键抑癌因子，可抑制胃癌的增殖和转移[3-4]；脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid binding protein 5,FABP5）在许多类型癌症中过表达，并可促进膀胱癌细胞的脂质代谢及恶性进展[5]，还可促进胃癌和宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和致癌性[6-7],FABP5抑制剂可通过促进前列腺癌症细胞凋亡而抑制其恶性进展[8]，由此可知miR-585-5p和FABP5是宫颈癌的潜在治疗靶点，而查询Starbase数据库发现两者间存在结合位点，因而推测miR-585-5p可能靶向调控FABP5表达，超声微泡是一种有价值的非病毒载体系统，可用于癌症的位点特异性和非侵入性基因治疗，具有促进治疗剂细胞内摄取的优点[9]。本文通过体外培养人宫颈癌细胞Hela并构建其裸鼠模型，探讨超声微泡介导miR-585-5p通过调节FABP5对宫颈癌细胞恶性进展的影响。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物、组织及细胞

SPF级雄性裸鼠{约7周龄，体质量（20±2)g，生产许可证号SCXK（闽）2018-0003，自厦门大学采购；收集本院宫颈癌患者手术后切除的人宫颈癌组织及其癌旁组织18例（均经患者本人或家属知情同意）；人子宫颈上皮细胞、人宫颈癌细胞Hela细胞自武汉普诺赛生命科技有限公司采购。

1.1.2主要试剂与仪器

SonoVue超声微泡造影剂（意大利Bracco公司）；甲基噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔二抗、兔抗人FABP5、Ki67及GAPDH一抗、结晶紫染色液（上海优宁维生物科技）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、Trizol、一步法实时荧光定量试剂盒（武汉纯度生物科技）等；FM-600倒置荧光显微镜（上海普丹光学仪器）；Multiskan FC酶标仪、Attune NxT流式细胞仪、QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统、XCell SureLock Mini-Cell小型蛋白电泳系统、XCell II Blot Module小型蛋白转印系统（赛默飞世尔科技），等。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR和Western blot检测人宫颈癌组织及其癌旁组织、人宫颈癌细胞Hela细胞、人子宫颈上皮细胞miR-585-5p、FABP5表达

人宫颈癌组织及其癌旁组织各剪下约0.3 g，剪碎后分别与Trizol混匀研磨，按其试剂说明书内方法提取癌组织及其癌旁组织总RNA备用。于40℃温水浴内快速解冻Hela细胞和人子宫颈上皮细胞，以含有10%胎牛血清与1%双抗的DMEM培养基复苏培养Hela细胞，以专用培养基复苏培养人子宫颈上皮细胞，传代后收集2种细胞沉淀，分别与Trizol混匀以同样方法提取细胞内总RNA，分别取组织和细胞内总RNA配制反应体系，通过一步法进行实时定量PCR反应，具体方法参照一步法实时荧光定量试剂盒说明书，用U6做miR-585-5p的内参，GAPDH做FABP5的内参，各基因循环阈值用2-ΔΔCt算法进行计算，得出FABP5、miR-585-5p的相对表达，引物序列见下表1。

表1本文基因引物序列

人宫颈癌组织及其癌旁组织各剪下约0.3 g，剪碎后分别与RIPA裂解液混匀研磨，按其试剂说明书内方法提取癌组织及其癌旁组织总蛋白样品液备用。Hela细胞和人子宫颈上皮细胞传代后收集其细胞沉淀，用RIPA裂解液以同样方法提取其中总蛋白，组织和细胞内总蛋白浓度均通过二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid,BCA）法测得，然后每个样本取15µg总蛋白上样后进行电泳分离，然后进行湿转转移，最终于硝酸纤维素膜上获得分离开的各组蛋白，剪下FABP5、GAPDH蛋白条带封闭后进行抗原抗体反应，以化学发光法显色后拍照，运用Image J软件定量其灰度值，然后计算FABP5/GAP-DH的灰度值之比，最终获得各组FABP5相对表达。

1.2.2分组处理Hela细胞后收集标本

参考文献[10]中方法制备微泡：将25 mg超声微泡造影剂溶于5 ml生理盐水，混匀后进行超声辐照（声强1.5 W/cm2，连续辐射30 s），重复5次（每次隔60 s），最终可得约2.5µm直径的微泡（浓度为3×108个/mL）。

以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h后随机分为对照组、空微泡组、miR-585-5p微泡组、miR-585-5p+FABP5过表达微泡组，空微泡组细胞加入微泡造影剂（与生理盐水以上述相同比例混匀）200µL,miR-585-5p微泡组细胞加入等量微泡造影剂的同时加入miR-585-5p mimics（剂量参照说明书指导及预实验结果设置），miR-585-5p+FABP5过表达微泡组细胞加入等量微泡造影剂的同时加入miR-585-5p mimics、FABP5过表达质粒（剂量参照说明书指导及预实验结果设置），以上述条件进行超声辐照，另外对照组细胞不处理，各组细胞于超声辐照后继续无菌培养24 h，收集其细胞沉淀存于液氮内备用。

1.2.3实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测各组Hela细胞miR-585-5p、FABP5表达

取出1.2.2中收集的各组Hela细胞沉淀，分别提取总RNA及总蛋白，然后进行实时荧光定量PCR实验检测各组miR-585-5p及FABP5 mRNA相对表达，进行免疫印迹实验检测各组FABP5蛋白相对表达，具体实验方法与1.2.1中相同。

1.2.4 MTT实验、Ki67免疫荧光染色与流式细胞实验检测各组Hela细胞增殖、凋亡

MTT实验：以1×104个/毫升的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，按1.2.2中步骤分组处理24 h，每孔加入适量MTT工作液孵育2 h，按MTT试剂盒说明指导测定各组细胞吸光度后算出其存活率，细胞存活率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

Ki67免疫荧光染色：以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，按1.2.2中步骤分组处理24 h，掉出DMEM培养基后漂洗细胞，4%多聚甲醛固定3 h、5%牛血清白蛋白溶液封闭、孵育兔抗大鼠Ki67一抗、生理盐水漂洗、避光孵育二抗、生理盐水漂洗、孵育DAPI染色液、生理盐水漂洗，然后用倒置荧光显微镜观察并任选4个视野拍照，运用Image J软件定量各组Ki67阳性细胞（呈绿色）数和总细胞数后算出其增殖率：增殖率（%）=Ki67阳性细胞数/总细胞数×100%。

流式细胞术检测：以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，按1.2.2中步骤分组处理24 h，收集各组细胞洗涤后计数测出其密度，每组取约5×105个细胞，采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒并按其说明指导行FITC、PI双染，然后上机于流式细胞仪内检测各组细胞凋亡情况，最终运用FlowJoTM 10数据分析软件分析得到各组细胞凋亡率。

1.2.5细胞划痕、Transwell侵袭实验检测各组Hela细胞迁移与侵袭

细胞划痕实验：以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，按1.2.2中步骤分组处理24 h，收集各组细胞洗涤后计数测出其密度，每组取约5×105个细胞接种在24孔板，贴壁生长12 h后于每孔中央划一条直线，洗去划痕内细胞后用显微镜采集各组细胞图像，运用Image J软件分析图像并定量各组划痕面积（记为S0h），于细胞培养箱中继续培养24 h，再次采集各组细胞图像后定量其划痕面积（记为S24h），按下式计算各组细胞迁移率：迁移率（%）=（S0h-S24h）/S0h×100%。

Transwell侵袭实验：以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，按1.2.2中步骤分组处理24 h，收集各组细胞洗涤后计数测出其密度，每组取约5×105个细胞，以不含胎牛血清的DMEM培养基制为单细胞悬液，接种在提前包被基质胶的24孔Transwell培养板上室内（同时于下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基），于细胞培养箱中继续培养24 h，取出下室内细胞生理盐水漂洗、孵育结晶紫染色液、生理盐水漂洗、孵育DAPI染色液、生理盐水漂洗，用倒置荧光显微镜观察各组细胞并任选4个视野拍照，用Image J软件定量各组细胞数目，取平均值即可得各组细胞侵袭数。

1.2.6构建Hela细胞移植瘤裸鼠模型并分组处理后检测其肿瘤体积与重量

制备Hela细胞移植瘤裸鼠模型，具体方法参考文献[11]：收集传代Hela细胞洗涤后计数，制得密度为2.5×108个/mL单细胞悬液，取裸鼠对其右后肢腋部消毒后皮下注射200µL该细胞悬液，7 d后观察到裸鼠右后肢腋部皮下出现肿瘤块即表明模型制备成功，随机分为对照组、空微泡组、miR-585-5p微泡组、miR-585-5p+FABP5过表达微泡组，按1.2.2中方法制备空微泡、miR-585-5p微泡、miR-585-5p和FABP5过表达质粒微泡后分组进行处理：对照组裸鼠瘤内注射生理盐水200µL，空微泡组裸鼠瘤内注射空微泡200µL,miR-585-5p微泡组裸鼠瘤内注射miR-585-5p微泡200µL,miR-585-5p+FABP5过表达微泡组裸鼠瘤内注射miR-585-5p和FABP5过表达质粒微泡200µL，除对照组外的其余3组于瘤内注射后立即进行超声辐照，参考文献[12]设定辐照条件：占空比为50%，频率1MHz，功率1W/cm2，时间120 s，各组裸鼠1次/2d，共处理6次。

于首次处理时（此时记为第0天）测定各组裸鼠肿瘤块长径a和短径b，按体积（mm3)=ab2/2算出各组裸鼠肿瘤体积，每3 d测量1次，直至第21天。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验检测Hela中miR-585-5p对FABP5的靶向调节

以1×105个/mL的密度将传代Hela细胞接种在24孔板，于细胞培养箱中无菌培养36 h，随机分为FABP5突变+miR-585-5p mimics阴性对照组（转染突变型FABP5 3′-UTR报告质粒+miR-585-5p mimics阴性对照）、FABP5突变+miR-585-5p mimics组（转染突变型FABP5 3′-UTR报告质粒+miR-585-5p mimics）、FABP5野生+miR-585-5p mimics阴性对照组（转染野生型FABP5 3′-UTR报告质粒+miR-585-5p mimics阴性对照）、FABP5野生+miR-585-5p mimics组（转染野生型FABP5 3′-UTR报告质粒+miR-585-5p mimics），用脂质体2000按上述分组进行转染，24 h后收集各组细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒并按其说明书内指导方法检测其双荧光素酶相对活性。

1.3统计学分析

本文实验数据运用软件GraphPad Prism 8.0进行统计分析，并使用均值±标准差的形式进行描述，多组间差异比较进行单因素方差分析，两两之间进一步差异比较进行SNK-q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-585-5p、FABP5在人宫颈癌组织及其癌旁组织、人子宫颈上皮细胞、Hela细胞表达

与人宫颈癌旁组织相比，人宫颈癌组织miR-585-5p表达降低（P<0.05),FABP5 mRNA与蛋白表达升高（P<0.05）；与人子宫颈上皮细胞相比，Hela细胞miR-585-5p表达降低（P<0.05),FABP5mRNA与蛋白表达升高（P<0.05）（图1、表2）。

图1宫颈癌组织及其癌旁组织、人子宫颈上皮细胞、Hela细胞FABP5表达（Western blot检测）

A.人宫颈癌旁组织；B.人宫颈癌组织；C.人子宫颈上皮细胞；D.Hela细胞

表2各细胞miR-585-5p、FABP5 mRNA与蛋白相对表达水平

2.2各组Hela细胞miR-585-5p、FABP5表达检测结果

与对照组相比，miR-585-5p微泡组细胞miR-585-5p表达升高（P<0.05),FABP5 mRNA与蛋白表达降低（P<0.05）；空微泡组细胞miR-585-5p表达、FABP5 mRNA与蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与miR-585-5p微泡组相比，miR-585-5p+FABP5过表达微泡组细胞miR-585-5p表达无明显变化（P>0.05),FABP5 mRNA与蛋白表达升高（P<0.05）（图2、表3）。

2.3各组Hela细胞增殖与凋亡检测结果

与对照组相比，miR-585-5p微泡组细胞存活率、增殖率降低（P<0.05），凋亡率升高（P<0.05）；空微泡组细胞存活率、增殖率、凋亡率无明显变化（P>0.05）。与miR-585-5p微泡组相比，miR-585-5p+FABP5过表达微泡组细胞存活率、增殖率升高（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05）（图3、图4、表4）。

2.4各组Hela细胞迁移与侵袭检测结果

与对照组相比，miR-585-5p微泡组细胞侵袭数、迁移率降低（P<0.05）；空微泡组细胞侵袭数、迁移率无明显变化（P>0.05）。与miR-585-5p微泡组相比，miR-585-5p+FABP5过表达微泡组细胞侵袭数、迁移率升高（P<0.05）（图5、图6、表5）。

图2免疫印迹检测各组Hela细胞FABP5表达

A.对照组；B.空微泡组；C.miR-585-5p微泡组；D.miR-585-5p+FABP5过表达微泡组

表3各组Hela细胞miR-585-5p、FABP5 mRNA与蛋白相对表达水平

2.5各组Hela移植瘤裸鼠肿瘤生长检测结果

与对照组相比，miR-585-5p微泡组裸鼠21 d时肿瘤体积降低（P<0.05）；空微泡组裸鼠21 d时肿瘤体积无明显变化（P>0.05）。与miR-585-5p微泡组相比，miR-585-5p+FABP5过表达微泡组裸鼠21 d时肿瘤体积升高（P<0.05）（图7、表6）。

2.6 Hela细胞中miR-585-5p对FABP5的靶向调节

查询Starbase数据库得到miR-585-5p与FABP5间结合位点，见图8。与FABP5野生+miR-585-5p mimics阴性对照组比较，FABP5野生+miR-585-5p mimics组相对荧光素酶活性降低（P<0.05);FABP5突变+miR-585-5p mimics阴性对照组与FABP5突变+miR-585-5p mimics组之间相对荧光素酶活性无明显差异（P>0.05）（表7）。

图3 Ki67免疫荧光染色检测各组Hela细胞增殖（×200)

图4流式细胞实验检测各组Hela/OXA细胞凋亡

表4各组Hela/OXA细胞存活率、增殖率、凋亡率

3、讨论

目前宫颈癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗、靶向及免疫治疗等，其治疗效果与其病理分类、临床分期、治疗方案的组合及患者依从性相关，早期患者5年存活率很高，但占临床大多数病例的中晚期患者5年存活率就较低，因而积极探寻宫颈癌发病机制并探寻更有效治疗手段具有重大临床价值[13-15]。miR-585-5p是一种具有肿瘤抑制作用的微小RNA因子，可通过调控典型致癌基因表达来介导舌鳞状细胞癌的发生及其恶性进展[16]，其在胃癌中具有强大的抗增殖和抗转移能力，可通过调控多种癌基因间相互作用来抑制胃癌细胞的增殖和转移[4]，且研究显示miR-585-5p表达失调与宫颈癌患者不良预后密切相关，可预示其极低的生存率[3]。因此，miR-585-5p可作为潜在的宫颈癌治疗靶点。超声微泡是一种有效的微小RNA递送系统，可促进癌细胞摄取具有抗癌作用的微小RNA分子，在包括宫颈癌在内的各种癌症的治疗中发挥重要作用[9,17]。本文结果显示相比癌旁正常组织与人子宫颈上皮细胞，人宫颈癌组织及细胞系内miR-585-5p表达降低，而以超声miR-585-5p mimics微泡处理人宫颈癌细胞Hela可促使其中miR-585-5p表达上调，并降低其存活率、增殖率、迁移率、侵袭数、裸鼠21d时肿瘤体积，升高其凋亡率，表明超声微泡可促使人宫颈癌细胞摄入miR-585-5p mimics，促进细胞表达分泌miR-585-5，进而抑制其增殖、裸鼠体内生长、迁移及侵袭，并诱导其凋亡，最终发挥明显抗肿瘤功效。

FABP5已被证明在许多癌症的进展中发挥重要作用，可促进骨肉瘤细胞脂肪酸代谢和其恶性发展[18]；沉默FABP5可抑制急性髓细胞白血病细胞甘油三酯、脂滴的产生积聚，减弱其细胞活力并诱导其凋亡[19]。研究显示FABP5在伴有淋巴结转移的宫颈癌患者体内中显著上调并与其不良预后相关，下调FABP5可抑制宫颈癌上皮-间充质转化、淋巴管生成和淋巴结转移[20]，由此确定FABP5是宫颈癌的潜在诊断生物标志物和治疗靶点。本文结果显示，相比癌旁正常组织与人子宫颈上皮细胞，人宫颈癌组织及细胞系内FABP5 mRNA与蛋白表达升高，且双荧光素酶报告基因实验结果表明Hela细胞内miR-585-5p可靶向下调FABP5表达，揭示miR-585-5p可通过靶向调控FABP5表达而介导宫颈癌发生及恶性进展过程；以超声miR-585-5p mimics微泡处理人宫颈癌细胞Hela可降低其FABP5 mRNA与蛋白表达，而以超声miR-585-5p mimics和FABP5过表达质粒微泡处理Hela细胞，可减弱超声miR-585-5p mimics微泡处理对Hela细胞增殖、裸鼠体内生长、迁移及侵袭的抑制作用，消除其对凋亡的促进作用，最终逆转超声miR-585-5p mimics微泡处理对宫颈癌恶性进展的抑制功效，揭示超声微泡介导miR-585-5p抑制宫颈癌细胞恶性进展是通过下调FABP5实现的。

图5各组Hela细胞迁移检测结果（细胞划痕实验，×200)

图6各组Hela细胞侵袭检测结果（Transwell侵袭实验，×200)

表5各组Hela细胞迁移率和侵袭数

图7各组Hela移植瘤裸鼠肿瘤生长曲线

表6各组Hela移植瘤裸鼠21 d时肿瘤体积

图8 miR-585-5p与FABP5间结合位点

表7各组Hela细胞相对荧光素酶活性值

综上所述，超声微泡介导miR-585-5p可能通过减弱FABP5表达而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭与裸鼠体内生长，促进其凋亡，延缓其恶性进展，最终发挥显著抗癌功效，本文为临床治疗宫颈癌提供了新的思路和作用靶点，有助于宫颈癌开发新型的分子靶向治疗技术及改善患者预后。

作者贡献声明高剑英负责实验操作、论文撰写；黄娟负责数据整理、统计分析；贾蓉负责研究指导、论文修改、经费支持

利益冲突声明所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道

参考文献:

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文章来源:高剑英,黄娟,贾蓉.超声微泡介导miR-585-5p通过调节FABP5对宫颈癌细胞恶性进展的影响[J].解剖学研究,2025,47(01):51-58+66.