宫颈癌作为全球女性健康的杀手,每年新发病例约50万,占所有癌症新发病例的5%,超过80%在发展中国家。每年26万多的妇女死于宫颈癌,低、中收入国家为著[1]。持续的HPV感染导致宫颈上皮细胞瘤变,局部的免疫微环境发生改变,促使肿瘤细胞发生免疫逃避,肿瘤组织形成、发展[2]。

B7-H4是新发现的免疫共刺激B7家族成员之一,具有抑制免疫调节作用[3]。相关研究[4]显示,在肿瘤微环境中,较多的Treg细胞能促进APC细胞表面B7-H4的表达,B7-H4与细胞表面的未知受体结合抑制肿瘤特异性T细胞的活化及增殖,从而导致肿瘤免疫逃逸[5]。人体中的B7-H4mRNA有两种转录产物[6],一种表达于细胞的表面受体,可能为B淋巴细胞、T淋巴细胞衰减子,主要表达在活化T细胞和静止B细胞上,能抑制免疫细胞的活化,BTLA可能具有上调B7-H4未明受体表达的作用,B7-H4和BTLA的直接作用未见报道,其具体受体及进一步作用机制尚不清楚;另外一种可溶性B7-H4,不仅能阻滞T细胞细胞周期中G0/G1期来抑制T细胞增生,还诱导T细胞凋亡,进一步抑制T细胞应答。相关实验[7]通过ELISA夹心法检测正常体检者、子宫肌瘤患者和宫颈癌患者血清sB7-H4水平,结果提示宫颈癌患者血清sB7-H4可能来源于肿瘤病灶,宫颈癌患者血清sB7-H4水平与鳞状上皮癌肿瘤(SCC)水平呈正相关;检测sB7-H4对宫颈癌的辅助诊断和疗效观察具有一定的临床意义。

凋亡受体Fas(CD95)是TNF受体大家族的一员,表达于细胞表面约36kDa的蛋白质分子[8]。Fas与Fas配体结合后迅速促进Fas阳性细胞凋亡。正常的细胞凋亡是机体抵制癌症的主要防御措施,凋亡过程的紊乱,细胞凋亡受抑制,使得这些细胞表现出明显地生长优势,DNA受损的细胞得以持续生存,突变物积聚,从而促进肿瘤的发生发展[9]。正常机体内,Fas与FasL结合会导致正常细胞和肿瘤细胞的凋亡,这一现象在CTLs(细胞毒性T细胞,cytotoxicTlymphocytes)细胞最为普遍,也是机体清除异物、排除异常细胞的主要方式,因此二者也参与了免疫环境的稳态。通常二者结合会导致Fas宿主细胞凋亡,CTLs免疫细胞的特异性免疫反应导致自身及抗原死亡,FasL在癌组织的过表达,使对癌症组织免疫的主要细胞CTLs异常凋亡,最终肿瘤细胞免于被活性细胞毒性T细胞的清除。有关皮肤癌[10]、口腔鳞癌[11]、子宫内膜癌[12]等多项实验研究验证Fas、FasL系统与肿瘤逃逸免疫监控相关,Fas表达的降低及FasL表达的升高促进肿瘤的恶性转移及肿瘤进展。

本研究通过分析162例宫颈标本(20例正常宫颈,30例CIN,112例宫颈癌)患者的病理资料,检测B7-H4分子和Fas、FasL蛋白在不同宫颈组织中表达,探讨三者在宫颈癌免疫逃逸的可能作用及相互关系。

1、资料与方法

1.1标本来源

选择陕西省肿瘤医院病理科2014-2018年的石蜡包埋标本162例,宫颈鳞癌112例(均未行治疗前标本),宫颈上皮内瘤变30例,正常宫颈组织20例,所有标本临床病理资料完整,均经过两名高级职称病理医生复审切片。根据FIGO临床宫颈癌分期标准:Ⅰ期30例,Ⅱ期44例,III期24例,IV期14例(112例宫颈癌病理均为治疗前标本,Ⅰ-Ⅱa期行手术治疗,Ⅱb-Ⅳ期行放化疗治疗)。

1.2试剂和方法

1.2.1主要试剂

B7-H4单克隆抗体(北京中杉生物有限公司);试剂盒和DAB显色试剂盒(自北京中杉生物有限公司);Fas兔抗人多克隆抗体(迈新生物技术开发公司);FasL兔抗人多克隆抗体(迈新生物技术开发公司)。

1.2.2方法

免疫组化SP法测定B7-H4和Fas、FasL的表达,实验步骤参照SP试剂盒说明书进行。一抗滴度B7-H4为1∶600,Fas为1∶50,FasL为1∶300。用已知阳性片(大肠腺癌组织)作阳性对照,PBS代替一抗作阴性对照。

步骤:①石蜡切片制作:固定:固定12h,脱水:无水酒精(I)、(II)各2h,透明:二甲苯(I)、(II)各30min,包埋:用石蜡(III)包埋组织,切片:切片机切成5～8μm,贴片:50℃温水中展片,捞片,烤片:68℃恒温箱内烤片2h;②SP三步法:脱蜡:60℃恒温烘烤20min,二甲苯(I)、(II)浸泡25min,水化:无水酒精(I)、(II)各2min,下行至95%、80%、70%酒精(I)(II)各2min,PBS冲洗2～3次,每次5min,阻断:3%H2O2去离子水孵育10min,PBS冲洗2～3次,每次5min,抗原修复:参照标准SP抗原修复,PBS冲洗2～3次,每次5min,封闭:山羊血清,室温下孵育20min。滴加I抗50μL,4℃过夜,PBS冲洗2～3次,每次5min,滴加辣根过氧化物酶标记的II抗40～50μL,室温静置1h,或37℃1h,PBS冲洗2～3次,每次5min,滴加SP,室温孵育30min～1h,PBS冲洗2～3次,每次5min,显色:DAB5～10min,自来水冲洗10分钟终止反应,复染:苏木精复染2min,盐酸酒精分化,自来水冲洗10～15min,常规脱水、透明、封片、镜检;③结果分析:每片选5个视野(400×),定量灰度扫描后分析。

1.3结果判定

B7-H4在胞膜/胞浆棕黄色染色为阳性,无染色为阴性。染色结果判断标准采用半定量分级法:阳性细胞数<10%为0分,10%～20%为1分,21%～45%为2分,46%～75%为3分,>75%为4分;细胞染色强度,阴性为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。根据阳性细胞数与相应染色强度乘积判定染色结果:0～1分为阴性;2～7分为阳性,其中2～5分为+～++(弱阳性),>6分为+++(强阳性)。Fas和FasL蛋白阳性细胞均表现为胞浆或胞膜呈棕黄色。而胞质、胞膜无着色者为阴性细胞。染色结果判断标准同上述。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0专用软件进行数据分析,采用χ2检验进行三组间两两比较,在α=0.05检验水准下,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同宫颈组织中B7-H4的表达

B7-H4染色位于细胞膜,深度不一,棕黄色至棕褐色。B7-H4在正常宫颈上皮不表达(-)、部分不典型增生宫颈上皮弱阳表达(+～++),在宫颈癌强阳表达(+++),见图1。20例正常宫颈组织中B7-H4均呈阴性表达(-),30例CIN组织中,8例CINI均阴性表达(-),10例CINII及12例CINIII组织中有6例弱阳表达(+～++)。112例未行新辅助化疗宫颈癌组织中,53例B7-H4表达阳性,阳性率为47.32%。宫颈癌组织中B7-H4阳性表达率明显高于CIN组和正常宫颈组织(P<0.05),见表1。

图1正常宫颈、不典型增生宫颈上皮、宫颈癌组织中B7-H4的表达(IHC×100)

A:B7-H4在正常宫颈的镜下着色;B:B7-H4在宫颈癌前病变CIN的镜下着色;C:B7-H4在宫颈癌组织的镜下着色。

表1不同宫颈组织中B7-H4的表达

注:a:正常对照组与CIN组相比;b:CIN组与宫颈癌组相比;c:宫颈癌组与正常对照组相比。

2.2不同临床期别宫颈癌组织中B7-H4的表达

宫颈癌组织中,B7-H4阳性表达率随着临床期别进展,B7-H4阳性表达率升高,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

2.3Fas在不同宫颈组织中的表达

Fas在20例正常宫颈组织,30例CIN组织,112例宫颈癌组织中的表达(图2),其阳性表达率分别为85.00%(17/20)、43.33%(13/30)和41.96%(47/112)。CIN、宫颈癌组织分别与正常宫颈组织相比具有显著性差异(P<0.05),见表3。

2.4FasL在不同宫颈组织中的表达

FasL在20例正常宫颈组织,30例CIN组织,112例宫颈癌组织中的表达(图3),其阳性表达率分别为20.00%(4/20)、50.00%(15/30)和56.25%(63/112)。CIN、宫颈癌组织分别与正常宫颈组织相比具有显著性差异(P<0.05),见表4。

表2不同临床期别的宫颈癌组织中B7-H4的表达

2.5B7-H4与Fas、FasL表达的相关性

在112例宫颈癌组织中,B7-H4阳性组和阴性组Fas的阳性表达率分别为28.30%,54.24%,两者相比具有显著差异(P<0.05);FasL的阳性表达率分别为79.25%,35.59%,两者具有显著差异(P<0.05),见表5。

3、讨论

HPV若要持续感染宿主,需要逃逸机体清除HPV感染的细胞,负性免疫调控分子B7-H4及凋亡蛋白Fas、FasL系统都参与了恶性肿瘤分子的免疫逃逸过程,促进肿瘤的发生、发展[13,14],二者之间是否关联参与宫颈癌肿瘤细胞免疫逃逸过程,未见相关报道。本研究对不同宫颈组织B7-H4,Fas、FasL的表达进行比较,分析三者之间的相关性,阐述其在宫颈癌发生发展过程中可能作用,用于更好地指导宫颈癌临床诊疗工作。

图2Fas在正常宫颈上皮及宫颈癌中的表达(IHC×100)

A:Fas在正常宫颈的镜下着色;B:Fas在宫颈癌组织的镜下着色。

表3Fas在不同宫颈组织中的表达

注:a:正常对照组与CIN组相比;b:CIN组与宫颈癌组相比;c:宫颈癌组与正常对照组相比。

表4不同宫颈组织中FasL的表达

注:a:正常对照组与CIN组相比;b:CIN组与宫颈癌组相比;c:宫颈癌组与正常对照组相比。

图3FasL在正常宫颈上皮及宫颈癌中的表达(IHC×100)

A:FasL在正常宫颈的镜下着色;B:FasL在宫颈癌组织的镜下着色。

表5112例B7-H4表达不同的宫颈癌组织Fas、FasL的表达n(%)

3.1B7-H4在宫颈癌组织中的表达及其意义

肿瘤细胞表面异常表达B7-H4与肿瘤侵袭性,预后不良相关,B7-H4在多种肿瘤中均有过度表达,而且其表达水平与肿瘤的临床分期、转移和预后有密切关系[15,16]。肿瘤细胞B7-H4的表达与肿瘤的临床和病理学特征密切相关,B7-H4高表达的患者肿瘤复发率和病死率往往较高,预后较差[17]。

本研究结果表明,随疾病进展,B7-H4的表达上调,正常的宫颈组织不表达B7-H4,而从CIN组织到宫颈癌组织,B7-H4阳性表达率增加(0%、20.00%、47.32%)。这与王婷婷[18]等人的实验结果基本一致。

本实验在此基础上还分析了B7-H4在112例宫颈癌组织从FIGO临床分期I期至IV期的表达,各期别宫颈癌组织B7-H4的阳表达率分别为I期16.67%,II期43.18%,III期70.83%,IV期85.71%,各组间相比差异具有统计学意义,说明宫颈癌临床期别越高B7-H4表达越高,提示肿瘤免疫调节分子B7-H4参与宫颈癌的进展。由于本实验仅收集2014-2018年病例,未能对宫颈癌的生存状况与B7-H4的表达进行生存分析。也有最新实验表明,B7-H4只作为一个可以预测预后生存的独立因素,没有与其显著相关的临床参数[19],导致实验结果不同的原因可能是实验条件不同及研究对象本身存在差异,例如自身的免疫状况及种族的差异。有实验还证实通过特异性单克隆抗体或可溶性抑制因子可以加强已确诊癌症CTL的杀伤力[20]。在宫颈上皮细胞长期持续感染HPV病毒,细胞发生变异[2],结合本实验结果,提示负性免疫共刺激分子B7-H4可能致使HPV宿主细胞乃至宫颈癌细胞逃逸机体免疫,肿瘤微环境中B7-H4+的免疫相关细胞,由于免疫应答能力被抑制,不能正常清除异常细胞,最终导致宫颈癌发生发展。B7-H4分子本身的特性及免疫学调节作用使其在临床诊疗中有重要价值,提供了一个针对宫颈癌及其他B7-H4+恶性肿瘤的新分子靶向治疗方法。

3.2不同宫颈组织中Fas、FasL的表达

Fas为最重要的促细胞凋亡基因之一,Fas与FasL结合,启动caspase级联反应,最终激活caspase-3,从而细胞凋亡。且二者的结合是激活体内Fas凋亡信号的唯一有效途径。它的异常与多种肿瘤发生密切相关,细胞内环境的稳定取决于细胞增殖与凋亡间的动态平衡;失控的增殖和凋亡与各种肿瘤密切相关;凋亡抑制可促进多种细胞癌变;Fas系统在细胞凋亡及肿瘤免疫逃逸方面发挥了重要的作用;以往众多研究结果显示:大多数良性肿瘤Fas的表达类似于其来源的正常组织,而恶性肿瘤的Fas表达明显下调或丢失,逃避体内Fas与FasL系统对其清除作用[21]。

本实验结果显示,CIN和宫颈癌组织中Fas的阳性表达率,分别为43.33%和41.96%明显低于正常对照组Fas蛋白的阳性表达率85.00%,而宫颈癌和CIN组相比无明显差异,肿瘤细胞Fas表达的降低,造成宫颈癌细胞逃逸了机体的免疫监控,凋亡减少,促进了肿瘤的发生、进展;宫颈癌组织中FasL蛋白的阳性表达率56.25%和CIN组织FasL阳性表达率50.00%明显高于正常宫颈组20.00%(P<0.01),而宫颈癌组与CIN组相比无显著差异,这与Wu[22]等人研究结果基本一致。另外Wu等人还发现FasL阳性表达率在有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组,提示FasL表达水平的增高,癌细胞的恶性程度也随之增加,其逃避机体免疫监视的能力也逐步增强,发生转移的可能性加大。还有研究结果表明[23],在ECTV感染过程中,Fas/FasL可以调节致敏DCs和Tregs的发育,导致免疫应答的无效。

在宫颈癌的发生过程中,持续的HPV病毒感染,癌细胞Fas表达降低,而FasL上调。Fas作为一种普遍表达的受体分子,可出现于多种细胞表面,但FasL的表达却有其特点,通常只出现于活化的T细胞和NK细胞,Fas与Fas配体结合后可迅速促进Fas阳性细胞凋亡,被活化的杀伤性免疫细胞能够最有效地以凋亡途径杀死靶细胞[24]。宫颈癌肿瘤微环境中,宫颈癌细胞高表达FasL与免疫相关细胞表面的Fas受体结合,导致免疫相关细胞,特别是CTLs启动凋亡程序而死亡,最终使得免疫细胞凋亡增加,而宫颈癌细胞由于Fas受体低表达及免疫细胞自身凋亡而免于凋亡或凋亡减少,得以无限增殖。FasL、Fas的异常表达可能参与宫颈癌的发生发展、进展。

3.3B7-H4与Fas、FasL表达的相关性

本研究结果显示,B7-H4阳性表达的宫颈癌组织中Fas阳性表达率28.30%,低于B7-H4阴性组54.24%,而FasL阳性表达率B7-H4阳性组为79.25%,高于B7-H4阴性组FasL阳性表达率35.59%,差异具有统计学意义。实验结果表明,在宫颈癌的发生、进展过程中,随着宫颈癌细胞B7-H4阳性表达率的升高,细胞的Fas水平降低,而FasL水平升高,提示宫颈癌细胞Fas表达与B7-H4呈负相关,FasL的异常表达与B7-H4正相关,B7-H4与Fas、FasL系统共同参与了宫颈癌的发生与进展。

目前国内外研究显示[25]:B7-H4作为B7家族的配位体,执行抑制免疫系统的功能在许多疾病,如癌症、同种异体排斥反应和自身免疫性疾病的受体分子还有待澄清。B7-H4抑制免疫应答主要通过两种途径:一种是增加细胞凋亡,另一种是诱导细胞停留在G0/G1期。关于第一种途径,有实验研究[26],通过用EB病毒感染B淋巴细胞,B细胞高表达B7-H4,并且在B7-H4相关抗体介入后,B淋巴细胞内发生了一系列连锁反应,细胞内活性氧物质增多,这些活性氧物质诱发FasL表达,细胞内caspases被激活,细胞色素c,凋亡诱导因子,核酸内切酶G等物质从细胞线粒体内释放出来,最终导致细胞凋亡。因此B7-H4可以加速肿瘤进展和减轻同种异体排斥反应。在体内有效阻断B7-H4将会对B7-H4阳性肿瘤是一个很有前景的免疫治疗方法[27,28]。正常机体内,Fas与FasL结合会导致正常细胞和肿瘤细胞凋亡,这一现象在CTLs细胞最为普遍,也是机体清除异物、排除异常细胞的主要方式,因此二者也参与了免疫环境的稳态。通常二者结合会导致Fas宿主细胞凋亡,CTLs免疫细胞的特异性免疫反应导致自身及抗原死亡也是机体对癌症组织及外来抗原免疫的关键,癌组织FasL的异常表达,诱导CTLs凋亡,使肿瘤细胞免于机体的正常清除。B7-H4为癌细胞的生长增殖提供免疫抑制的环境,同时上调癌组织中FasL的表达、降低其内Fas蛋白水平,从而使得肿瘤细胞及异常的HPV感染细胞免于凋亡,增殖失衡,两者共同促进宫颈癌的发生、发展。

本实验研究结果显示,负性共刺激分子B7-H4、凋亡分子Fas、FasL在宫颈癌进展过程的异常表达之间相关,其中宫颈癌细胞中B7-H4及FasL的高表达呈正相关,B7-H4与Fas系统在凋亡通路中共同促进了宫颈癌的发生,进展。在相关实验中[26],通过感染EB病毒导致机体B淋巴细胞表面B7-H4的表达,同时增加细胞内活性氧ROS,诱发Fas配体表达,随后引起Fas介导的凋亡启动;并且B7-H4的参与明显抑制了EB病毒阳性的淋巴细胞,通过下调CDK4/6,CDK2等细胞周期素,使之停滞在G0-G1细胞周期。结合本实验中宫颈组织随疾病进展B7-H4的表达上调,提示随着高危HPV病毒持续感染,可能上调负性共刺激分子B7-H4在宫颈肿瘤细胞、免疫细胞的表达,而在B7-H4表达的宫颈癌细胞FasL升高,宫颈癌细胞高表达的FasL与免疫相关免疫细胞表面的Fas受体结合,导致免疫相关细胞,特别是CTLs启动凋亡程序而死亡,最终使得免疫细胞凋亡增加,而宫颈癌细胞由于Fas受体低表达及免疫细胞自身凋亡而免于凋亡或凋亡减少,得以无限增殖,从而使宫颈癌病情进展。

上述可能是宫颈癌的免疫逃逸机制之一,但HPV病毒是否为宫颈上皮细胞B7-H4过表达的直接原因,高表达的负性免疫共刺激分子B7-H4如何诱发机体免疫细胞FasL凋亡系统启动,最终导致免疫细胞被破坏,肿瘤细胞逃逸机体正常免疫,得以无限增殖、扩散,具体的分子机制还有待于进一步研究证实。

参考文献：

[18]王婷婷,徐曼,耿卫朴,等.B7-H4在人子宫颈癌的表达及其与肿瘤内浸润T细胞亚群的相关性研究[J].中国免疫学杂

胡晓君,雷磊,胡艳,邹红燕,付玉兰,王国庆,赵西侠.B7-H4及Fas､FasL与宫颈癌免疫逃逸机制的关系[J].现代肿瘤医学,2020,28(21):3765-3770.

基金:陕西省卫生厅项目(编号:2016D051).