宫颈癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤;据有关统计,我国每年新发宫颈癌病例约15万,占全球总数的1/3,现已严重危害女性健康[1]。近年来,早期宫颈癌患者行根治性手术及放疗已明显提高预后,然中晚期患者对放化疗不敏感,导致患者预后不良。如何降低宫颈癌的发生率仍是目前亟待解决的重要问题。因此,深入探究宫颈癌的分子生物学机制,探寻新的、有效治疗靶点及药物对宫颈癌的临床诊断及治疗具有重要意义,也是当今肿瘤研究的方向之一。固醇调节原件结合蛋白(sterolregulatoryelement-bindingproteins,SREBPs)是脂代谢的调节者,通过转录性调节维持胆固醇和脂肪酸代谢的平衡[2]。大量研究证实SREBPs在众多恶性肿瘤中具有癌基因的作用,参与调节脂代谢促进癌症的发展[3]。脂肪抑制素最初是由化学实验合成用来抑制胰岛素诱导的脂肪生成的抑制剂。但经研究发现[4,5],脂肪抑制素是SREBPs通路的一种化学抑制剂,能够抑制SREBPs调节的脂代谢基因及其活化过程。且有研究证实[6]脂肪抑制素在前列腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中均具有抗肿瘤作用。因此,推测脂肪抑制素应对宫颈癌也具有抗肿瘤作用,但目前鲜见此方面的研究报道。所以,本研究对脂肪抑制素在宫颈癌中的抗肿瘤作用进行了初步探究,以期为宫颈癌的治疗提供新的借鉴。

1、材料与方法

1.1实验细胞及化合物来源

研究所用细胞系为宫颈癌细胞系SiHa,购自中国科学院细胞库;所用化合物为脂肪抑制素,由脂肪抑制素A固体粉末(购自美国MedChemExpress公司)与DMSO溶解配比(10mg∶3.3966mL)制成的储备液,浓度10000μmol/L,于-80℃低温箱储存备用,使用时取出、复温,利用相应培养基进行稀释,工作液中DMSO终浓度低于0.1%。

1.2主要试剂及设备

DMEM培养基、孔板购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、0.25%无EDTA胰蛋白酶购自美国Gibco公司;二甲基亚砜(DMSO)、MTT粉末购自德国Sigma公司;结晶紫染色液购自海门碧云天生物技术研究所;1%多聚甲醛、乙醇购自北京化工厂;细胞周期检测/凋亡检测试剂盒、Matrigel基质胶、流式细胞仪购自美国BDBiosciences公司。

1.3细胞培养

液氮中取出冻存SiHa细胞,快速移至37℃恒温箱复苏、融化,后转移到离心管加入细胞完全培养基,800r/min离心,弃上清液,再次加入细胞完全培养基,吹打混匀,接种于培养皿中重新加入适量培养基,摇匀置入37℃、5%CO2孵育箱进行培养。次日,镜下观察细胞状态,当SiHa细胞达到指数生长阶段时进行传代冻存,并用传代细胞进行后续实验。

1.4MTT法检测细胞增殖

1.4.1细胞增殖检测

取对数生长期细胞消化、离心,培养基重悬细胞调整细胞浓度为8×104个/mL,均匀接种于96孔板,每孔加入100μL细胞悬液,设置复孔及调零孔(制3板)。后放入37℃、5%CO2孵育箱过夜。次日,镜下观察细胞贴壁状态良好时,分别更换含有空白对照、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L脂肪抑制素培养基,记录加药时间,再次孵育培养。于加药后24h、48h、72h时各取一板,每孔滴加20μL5mg/mLMTT溶液,孵育培养4h。后吸除多余MTT液及培养基,避光加入DMSO100μL摇匀,采用酶标仪检测490nm波长时的OD值。实验重复3次,分别计算每次各浓度细胞存活率,绘制药物浓度与细胞存活率相关曲线图,利用GraphPadPrism7.0统计软件计算脂肪抑制素对SiHa细胞系的半数抑制浓度(IC50)值。

1.4.2生长曲线分析

方法同检测细胞增殖大体一致,重悬细胞浓度为4×104个/mL,接种于96孔板(制6板)行相关处理孵育,次日更换含有空白对照、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L脂肪抑制素培养基,于加药后0～5天各取一板孵育培养,检测OD(490nm)值,绘制时间与OD值相关生长曲线图。

1.5平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期细胞消化、离心,培养基重悬细胞调整细胞浓度为200个/mL,均匀接种于6孔板,每孔加入细胞悬液1mL;后将6孔板放入37℃、5%CO2孵育箱过夜。次日,分别更换含有空白对照、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L脂肪抑制素培养基,并记录加药时间。再次置入孵育箱连续培养2周,每4天更换培养基1次。观察克隆细胞数>50个时终止培养,弃上清,PBS液清洗。甲醇固定清洗,加入结晶紫染色液避光染色20min左右,冲洗干燥。重复试验3次,定量分析计数>50个的细胞克隆数目,克隆形成率=克隆数目÷接种细胞数×100%。

1.6Transwell实验检测细胞侵袭及迁移

1.6.1细胞侵袭检测

取对数生长期细胞更换含有空白对照、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L脂肪抑制素培养基,37℃、5%CO2孵育培养48h;加入8∶1比例Matrigel基质胶与无血清培养基混合液100μL;置入孵育箱过夜、凝固、培养48h,消化、离心,重悬细胞调整实验浓度;Transwell小室的上室加入细胞悬液,下室加入细胞完全培养基及趋化因子,继续孵育培养;后细胞固定,加入结晶紫染色液染色;实验重复3次,取镜下5个视野拍照计数。

1.6.2细胞迁移检测

实验不需在Transwell小室的上室铺Matrigel基质胶,将细胞悬液加入小室培养24h,其它方法基本同侵袭检测。

1.7流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡

1.7.1细胞周期检测

取对数生长期细胞更换含有空白对照、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L脂肪抑制素培养基,37℃、5%CO2孵育培养48h;0.25%无EDTA的胰蛋白酶消化细胞,8000r/min离心5min,取沉淀加入PBS缓冲液重悬细胞,离心;加入适量多聚甲醛固定细胞,离心,取沉淀重悬加入70%预冷乙醇溶液透化细胞,4℃冰箱过夜。1500r/min离心,取沉淀继续重悬洗涤离心、染色。重复3次,上机操作获取DNA含量直方图,计算细胞周期各时相细胞百分比。

1.7.2细胞凋亡检测

细胞处理及培养方法同周期检测,重悬细胞沉淀,控制细胞浓度1×104个/mL,每组分四管各加细胞悬液100μL,后进行染色处理,避光孵育15min。实验重复3次,上机获取细胞凋亡流式图,计算早/晚期凋亡细胞所占百分比。

1.8统计学分析

所有检测实验均重复3次,采用GraphPadPrism7.0软件进行统计分析,所得数据均以x¯±s表示,组间比较采用多因素方差分析或独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

采用MTT实验检测脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。相同浓度的脂肪抑制素随着作用时间的延长,对SiHa细胞增殖的抑制作用逐渐增强(P<0.05);在相同作用时间内,高浓度脂肪抑制素对SiHa细胞增殖的抑制作用更强,具有时间和剂量依赖性,各浓度组组内差异有统计学意义(P<0.05),见图1。利用GraphPadPrism7.0软件计算得出72h时脂肪抑制素对SiHa细胞的IC50为16.98μmol/L。

图1脂肪抑制素抑制SiHa细胞增殖

根据所得IC50,选择合适浓度进行研究脂肪抑制素对宫颈癌细胞生长曲线的影响。与空白对照组相比,脂肪抑制素可明显降低SiHa细胞OD值,浓度越高OD值降低越明显,差异具有统计学意义(P<0.001),且具有时间和剂量依赖性(图2)。

图2脂肪抑制素抑制SiHa细胞生长

2.2脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞克隆形成能力的影响

采用平板克隆形成实验检测脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞克隆形成能力的影响。各脂肪抑制素组细胞克隆形成率较空白对照组明显降低,且浓度越高细胞克隆形成率越低,具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.01),见图3。

2.3脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞侵袭及迁移能力的影响

Transwell侵袭/迁移实验检测脂肪抑制素对SiHa细胞侵袭/迁移能力的影响。与空白对照组相比,各脂肪抑制素组SiHa细胞侵袭/迁移能力明显降低,且脂肪抑制素浓度越高,SiHa细胞侵袭/迁移能力越弱,具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.001),见图4。

图3脂肪抑制素抑制SiHa细胞克隆形成能力

图4脂肪抑制素抑制SiHa细胞侵袭及迁移

2.4脂肪抑制素对宫颈癌SiHa细胞周期及凋亡的影响

流式细胞术检测脂肪抑制素对SiHa细胞周期的影响。与空白对照组相比,低浓度脂肪抑制素(10μmol/L)时SiHa细胞处于G0-G1期及G2/M期的细胞百分比无统计学差异(P>0.05);处于S期的细胞百分比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度脂肪抑制素(20μmol/L、40μmol/L)使SiHa细胞处于G2/M期的细胞百分比明显增加,处于G0-G1期及S期的细胞百分比明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05),见图5。

流式细胞术检测脂肪抑制素对SiHa细胞凋亡的影响。脂肪抑制素浓度较高(20μmol/L、40μmol/L)时,SiHa细胞早期凋亡率及早期+晚期凋亡率较空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);仅脂肪抑制素浓度为40μmol/L时的晚期凋亡率较空白对照组晚期凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05);脂肪抑制素浓度较低(10μmol/L)时细胞凋亡率变化不明显,无统计学差异(P>0.05),见图6。

图5脂肪抑制素对SiHa细胞周期的影响

3、讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,近年来其发病率逐渐趋向年轻化。目前宫颈癌的病因尚不明确,但研究发现[7],宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)是宫颈癌的前期病变,具有双向发展的可能性;而高危型人乳头瘤病毒(highrisk-humanpapillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌发生及CIN进展为宫颈癌的必要条件,及时诊断和正确处理是预防和治愈宫颈癌的关键。因此,找寻更加有效的诊断及治疗方法是近年来研究的热点。

脂代谢紊乱参与肿瘤形成的多方面,大量研究证明[8,9],肿瘤细胞为维持较高的增殖率、抵抗细胞死亡信号,通过重新编程脂代谢及调整其代谢途径来满足癌细胞的高代谢需求。既往研究发现[10],在子宫内膜癌中患有肥胖、糖尿病等代谢紊乱的患者其患病风险明显较高,高发病率、高死亡风险等与肥胖因素密切相关。BMI>30kg/m2的患者其患病风险是非肥胖患者的三倍,脂代谢在子宫内膜癌中明显上调[11]。而女性肥胖、体重超重也是增加宫颈癌的病因之一,是否脂代谢在宫颈癌中也呈此表达,尚无研究证实。

图6脂肪抑制素促进SiHa细胞凋亡

SREBPs由SREBP-1和SREBP-2两种基因进行编码,具有SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2三种亚型[3]。研究表明[12],SREBPs在恶性肿瘤中具有癌基因作用,而SREBP-1是脂肪酸代谢的调节者。有研究显示[13,14],癌组织中SREBP-1表达水平较正常组织明显增高,其水平与癌症的发生发展具有正向相关性;敲除癌细胞中SREBP-1可抑制癌细胞的增殖、促进凋亡、降低癌细胞的克隆形成能力。表明阻断SREBP调控的脂代谢通路可作为癌症治疗的新方法。脂肪抑制素作为SREBP通路的一种抑制剂,可能对脂代谢上调的肿瘤具有抗癌作用[5]。WILLIAMS[15]研究证实了在脑胶质瘤细胞中脂肪抑制素具有抗肿瘤作用。LI等和SEKAR等[16,17]也曾研究证实,脂肪抑制素能够抑制前列腺癌、胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,诱导其细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

目前多项研究已证实脂肪抑制素在多种恶性肿瘤中均具有抗肿瘤作用,因此,本研究对脂肪抑制素在宫颈癌中的作用机制进行了探究分析。本研究MTT实验显示,脂肪抑制素明显抑制SiHa细胞的增殖,降低其生长的OD值,具有时间和剂量依赖性(P<0.05),并利用软件GraphPadPrism7.0计算得出脂肪抑制素对SiHa细胞72h时的IC50值为16.98μmol/L。平板克隆形成实验显示,脂肪抑制素可明显降低SiHa细胞的克隆形成能力,具有剂量依赖性(P均<0.01)。Transwell侵袭/迁移实验显示,脂肪抑制素明显抑制SiHa细胞的侵袭/迁移能力,具有剂量依赖性(P均<0.001)。流式细胞术检测细胞周期及凋亡显示,较高浓度的脂肪抑制素可诱导SiHa细胞的细胞周期停滞在G2/M期,促进SiHa细胞的凋亡(P均<0.05)。本研究结果初步证实脂肪抑制素在宫颈癌细胞中也发挥抗肿瘤作用,可作为宫颈癌治疗的新药物,但其潜在的分子机制还需后续研究进一步探讨。

综上,脂肪抑制素能抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移,降低细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡,诱导细胞周期停滞在G2/M期,在宫颈癌细胞中同样具有抗肿瘤作用,可作为宫颈癌治疗的新药物。

参考文献：

[3]邱春萍,姜洁.SREBP在肿瘤中的作用研究进展[J].实用肿瘤杂志,2013,28(04):444-448.

[7]魏丽惠.HPV感染现状及在宫颈癌和癌前病变筛查中的意义[J].实用妇产科杂志,2017,33(02):81-83.

[10]凯赛尔·艾则孜,艾克拜尔·艾力.代谢组学在肥胖症及肥胖相关疾病研究中的应用现状[J].中华肥胖与代谢病电子杂志,2017,3(03):150-153.

[12]刘斌亮,马飞.肿瘤治疗与血脂代谢异常[J].中国实用内科杂志,2018,38(07):599-603.

杨真,纪军,於永爱,刘立峰,金仙玉.脂肪抑制素对宫颈癌细胞增殖､克隆形成､侵袭､迁移的抑制作用及相关机制研究[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1113-1117.

基金:辽宁省卫生和计划生育委员会资助项目(编号:2018312651);大连市医学科学研究计划项目(编号:1711006)