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LINC01305表达下调抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡的机制研究

2021-09-14 144 上传者：管理员

摘要：目的探究LINC01305在宫颈癌细胞增殖和凋亡中的作用和机制。方法通过RT-PCR检测宫颈癌组织以及细胞系中LINC01305的表达。将HeLa分为Control组,siRNA-NC组和siRNA-LINC01305组。MTT法和流式细胞术分析细胞增殖和凋亡。预测LINC01305的靶miRNA,双荧光素酶报告基因检测进行验证。RT-PCR检测miR-217在宫颈癌组织中的表达,并分析LINC01305和miR-217在宫颈癌组织中表达的相关性。结果与癌旁组织或END1/E6E7细胞相比,LINC01305在宫颈癌组织和细胞中表达均显著升高(P<0.01)。与siRNA-NC组相比,下调LINC01305表达抑制了宫颈癌细胞的增殖(P<0.01),同时促进了细胞凋亡的发生(P<0.01)。MiR-217是LINC01305的靶点,在宫颈癌组织中表达明显降低(P<0.01),且与LINC01305表达呈负相关(r=-0.7318,P<0.01)。siRNA-LINC01305组中miR-217的表达高于siRNA-NC组(P<0.01)。结论LINC01305可能通过靶向miR-217促进宫颈癌细胞增殖并抑制细胞凋亡,发挥促癌作用。

关键词：
LINC01305
凋亡
增殖
宫颈癌
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宫颈癌严重影响女性生命健康和生活质量[1]。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA）是内源非蛋白质编码RNA的一个子类别，在包括宫颈癌等多种癌症发展和进程中发挥重要作用[2]。LINC01305作为一种新发现的lncRNA[3]。目前LINC01305在宫颈癌增殖和凋亡中的作用功效和潜在机制尚不清楚。本研究旨在探究LINC01305对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。

一、材料与方法

1.组织样本和细胞系：收集山东省滕州市中心人民医院2018年6月至2020年3月收治的35例对宫颈癌组织样本和对应癌旁组织样本，并通过病理组织学对所有样本进行检测确认。患者年龄43～74岁，平均（56.93±9.64）岁。排除有抗肿瘤治疗史病例，所有患者均签署知情通知书。本研究获得医院伦理委员会批准。本试验所用正常宫颈细胞株END1/E6E7和宫颈癌细胞系C4-1、Caski、C-33A、SiHa、HeLa均购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。

2.方法：(1)细胞培养、处理及MTT细胞增殖实验：10%胎牛血清RPMI-1640培养基，加入100U/ml双抗溶液培养细胞。对数生长期细胞胰蛋白酶（0.25%）消化传代；将细胞分成：Control组、siRNA-NC组、和siRNA-LINC01305组。对数生长期细胞接种至96孔板，转染后0、24、48、72h加入5μg/μl的MTT溶液，孵育4h后加入DMSO溶液终止反应。利用酶标仪测定细胞在490nm的波长下的吸光度值（OD）。将空白作为对照，评估细胞增殖活力，每组5个重复；(2)流式细胞术检测细胞凋亡：转染处理48h，按照AnnexinV-FITC/PI说明书，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次；(3)组织和细胞RNA提取及荧光定量PCR实验：称取组织样本加入800μlTrizol试剂利用匀浆器匀浆，加入200μl氯仿提取RNA。4℃12000r/min离心取上清，加入等体积异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤，风干后用无RNA酶水溶解RNA。细胞转染48h计入800μlTrizol试剂提取细胞总RNA。反转录合成cDNA，进行RT-qPCR检测实验。反应条件：95℃30s;40个循环95℃5s;60℃30s。LINC01305表达使用GAPDH作为内参，miR-217表达使用U6作为内参，定量结果采用2-ΔΔCt表示；(4)双荧光素酶活检测：PCR扩增种子序列片段，双酶切方式将片段插入双荧光报告质粒。报告质粒和突变质粒与miR-217和NC共转染至293T细胞内，转染24h后，收集细胞，双荧光报告基因检测试剂盒检测细胞中海肾荧光和萤火虫荧光素酶的活性。

3.统计学分析：采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料表示为均值±标准误，两组间样本均值差异分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.LINC01305在宫颈癌组织和细胞中高表达：宫颈癌组织（1.39±0.06）中LINC01305的相对表达量相较于癌旁组织（1.00±0.06）异常升高（P<0.01）。与END1/E6E7细胞相比（1.000±0.09),LINC01305在宫颈癌细胞C4-1(1.36±0.05),P<0.01、Caski(1.41±0.09),P<0.01、C-33A(1.79±0.07),P<0.01、SiHa(2.02±0.07),P<0.01和HeLa(2.17±0.10),P<0.01中相对表达量均上调。

2.siRNA-LINC01305的转染效率及对HeLa细胞增殖的影响：Control组（1.00±0.06）和siRNA-NC组（0.96±0.08)LINC01305相对表达量差异无统计学意义；siRNA1-LINC01305组[(0.38±0.03),P<0.01]和siRNA2-LINC01305组[(0.30±0.02),P<0.01)]LINC01305相对表达量相较于siRNA-NC组显著降低。siRNA-LINC01305组宫颈癌HeLa细胞增殖活力相较于siRNA-NC组下降（P<0.01），而siRNA-NC组和对照组中HeLa细胞的增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）。

3.siRNA-LINC01305对HeLa细胞凋亡的影响：siRNA-LINC01305组发生早期及晚期凋亡细胞比例相较于siRNA-NC组显著增多（P<0.01），而siRNA-NC组和对照组细胞凋亡比例差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

图1LINC01305影响HeLa细胞的凋亡

4.miR-217是LINC01305的靶标及在宫颈癌组织中的低表达：LncBase数据库预测显示LINC01305存在能够与miR-217靶向互补结合位点。双荧光素酶基因报告实验结果显示，与NC组相比，转染miR-217mimics显著降低了野生型LINC01305的荧光素酶活性（P<0.01），而突变型LINC01305荧光素酶活性无变化。宫颈癌组织（0.62±0.05）中miR-217的相对表达量相较于癌旁组织（1.00±0.06）异常降低（P<0.01），且其表达与LINC01305呈现显著负相关性（r=-0.7318,P<0.01）。

5.siRNA-LINC01305增加miR-217的表达：与siRNA-NC组（0.94±0.08）相比，siRNA-LINC01305组（2.47±0.29)HeLa细胞中miR-217的相对表达量明显增加（P<0.01），而Control组（1.00±0.05）和siRNA-NC组中miR-217表达差异无统计学意义（P>0.05）。

三、讨论

本研究检测了宫颈癌组织和不同宫颈癌细胞系（C4-1、Caski、C-33A、SiHa、HeLa）中LINC01305的表达，结果发现LINC01305在宫颈癌中表达异常增加。Luo等[4]和Jiang等[5]分析数据集GSE63514宫颈癌差异lncRNA发现LINC01305在宫颈癌组织中表达明显上调，表明LINC01305可能在宫颈癌的发生发展中发挥一定作用。近期，有学者发现LINC01305亚细胞定位在宫颈癌SiHa细胞核中，LINC01305表达沉默能够通过靶向TNXB基因抑制PI3K/Akt信号传导途径，抑制SiHa细胞的迁移、侵袭以及EMT过程[6]。然而LINC01305对宫颈癌的增殖和凋亡产生何种影响未知。因此，我们在LINC01305表达上调最显著的HeLa细胞中转染siRNA-LINC01305干扰片段，检测发现下调LINC01305表达明显减弱了HeLa细胞的增殖活力，并增加了HeLa细胞早期凋亡和晚期凋亡比例，说明LINC01305能够促进HeLa细胞的增殖、抑制细胞凋亡的发生，在宫颈癌发展进程中可能发挥促癌因子作用。研究表明，lncRNA与特定的miRNA相互作用，影响下游特定mRNA表达，调节癌症的进展[7]。本研究实验证实miR-217是LINC01305的潜在靶标，miR-217在宫颈癌组织中显著低表达，且其表达与LINC01305著负相关性。另外，宫颈癌细胞中抑制LINC01305表达明显增加了miR-217表达。已有学者在宫颈癌组织以及细胞中发现miR-217表达异常下调，并能够靶向下游MAPK1关键基因影响细胞的增殖活力、侵袭迁移能力，加速细胞凋亡，抑制宫颈癌的恶性发展[8]；另外，miR-217能够抑制KRAS表达，增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。因此，推测LINC01305可能通过与miR-217相互作用，加速宫颈癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡。

综上所述，LINC01305在宫颈癌组织和细胞中表达异常升高，下调LINC01305表达明显抑制了HeLa细胞增殖、促进了细胞凋亡发生，其作用机制可能与靶向抑制miR-217表达有关。

文章来源：柴守辉,王福萍,宋萌萌,张萌,殷宪明.LINC01305表达下调抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡的机制研究[J].中国妇产科临床杂志,2021,22(05):508-509.