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LncRNAGASL1对宫颈癌细胞增殖的影响及其机制探讨

2021-09-14 96 上传者：管理员

摘要：：目的观察长链非编码RNAGASL1(LncRNAGASL1)对宫颈癌细胞增殖的影响,并对其机制进行探讨。方法回顾性收集2012年4月至2019年5月海南现代妇婴医院及海南医学院第二附属医院收治的72例宫颈癌组织,分为NC组、LncRNAGASL1组,同时设空白对照组,RTFQ-PCR检测LncRNAGASL1表达,分析LncRNAGASL1表达与宫颈癌病理的关系。结果与NC组比,LncRNAGASL1组LncRNAGASL1表达升高(P<0.01),空白对照组和NC组无差异。NC组细胞呈纺锤形、梭型,LncRNAGASL1组呈鹅卵石形态,空白对照组和NC组无差异。72h时,与NC组比,LncRNAGASL1组细胞增殖活力降低(P<0.01),空白对照组和NC组无差异。与NC组比,LncRNAGASL1组细胞侵袭率降低(P<0.01),空白对照组和NC组无差异。与NC组比,LncRNAGASL1组FN表达下调(P<0.01),E-cad上调(P<0.01),空白对照组和NC组无差异。与癌旁组织比,宫颈癌LncRNAGASL1表达降低(P<0.01)。LncRNAGASL1与年龄无相关性(P>0.05),肿瘤直径较大、FIGO分期较晚、分化程度较低和淋巴结转移LncRNAGASL1表达降低(P<0.05)。结论LncRNAGASL1能抑制宫颈癌细胞C-33A增殖和侵袭,与宫颈癌病理参数相关,可能与将完全型EMT表型转变为不完全型有关。

关键词：
上皮间质转化
增殖
宫颈癌
长链非编码RNAGASL1
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宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重危害女性的身心健康。长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)属于非编码RNA[1]。LncRNAGASL1为lncRNA的家族成员，在胃癌、前列腺癌中发挥抑癌效应[2,3]。但LncRNAGASL1在宫颈癌的作用报道较少。本研究以慢病毒转染法过表达LncRNAGASL1，检测宫颈癌癌组织的LncRNAGASL1，探讨LncRNAGASL1与宫颈癌发病的关系。

材料与方法

一、实验材料

(1)细胞：人宫颈癌C-33A细胞系购自南京科佰生物科技有限公司；(2)试剂：MEM培养基购自美国Gibco公司；FN抗体、E-cad抗体、GAPDH抗体购自美国CST公司；抗兔IgG-HRP二抗购自上海爱必信公司；LncRNAGASL1慢病毒表达载体转染试剂盒购自上海吉玛公司；实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQ-PCR）试剂盒购自大连宝生物公司；(3)仪器：MiniVE电泳设备(美国GE公司)；ABI7300型Q-PCR(美国ABI公司)；imark酶标仪(美国BIORAD公司)。

二、细胞实验方法

(1)细胞培养、慢病毒转染及分组：将转染空载体慢病毒和LncRNAGASL1过表达慢病毒的细胞设为空载体组(NC组)和LncRNAGASL1过表达组(LncRNAGASL1组)，同时设空白对照组；(2)RTFQ-PCR检测LncRNAGASL1表达：以RT-PCR试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA，在RTFQ-PCR系统行扩增，2(-△△Ct)法计算LncRNAGASL1的相对表达；(3)MTT法检细胞活力；(4)Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力：用MEM培养基将Matrigel基质胶稀释至250μg/ml，将细胞消化重悬至5×105个/ml，计算细胞侵袭率；(5)蛋白印记法检测各蛋白表达：以RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。试验重复5次。

三、临床试验方法

1.研究对象：收集2012年4月至2019年5月在海南现代妇婴医院及海南医学院第二附属医院就诊且行手术治疗的72例宫颈癌患者的癌组织为研究组，选择癌旁组织为对照组。纳入标准：(1)术前未接受宫颈癌治疗；(2)未合并其他恶性肿瘤。排除标准：(1)术前接受抗癌治疗者；(2)合并严重的心、肝和肾功能障碍。

2.RTFQ-PCR检测各组织的LncRNAGASL1表达：将癌及癌旁组织分别在液氮中研磨，置于EP管中，TRIZOL法提取细胞总RNA。分析LncRNAGASL1表达与宫颈癌病理的关系。

四、统计学处理

采用SPSS17.0进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析、t检验或LSD-t分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组细胞LncRNAGASL1表达和各组细胞形态

空白对照组、NC组及LncRNAGASL1组LncRNAGASL1分别为(0.11±0.01)、(0.10±0.01)和(1.12±0.10)。空白对照组和NC组无差异，与NC组比，LncRNAGASL1组LncRNAGASL1表达升高(P<0.01)。空白对照组和NC组细胞呈纺锤形、梭型，LncRNAGASL1组呈鹅卵石形。空白组和NC组细胞活力曲线相类似，LncRNAGASL1组细胞活力曲线平缓。72h时空白对照组、NC组及LncRNAGASL1组细胞活力分别为(288.20±20.20)%、(293.25±19.55)%和(182.30±15.05)%，空白组和NC组细胞活力无差异，与NC组比，LncRNAGASL1组细胞活力降低(P<0.01)。

二、各组细胞侵袭能力变化

空白对照组、NC组及LncRNAGASL1组细胞侵袭率分别为100%、(98.8.5±5.55)%和(32.33±3.08)%，空白组和NC组细胞侵袭率无差异，与NC组比，LncRNAGASL1组细胞侵袭率降低(P<0.01)。

三、各组细胞FN和E-cad蛋白表达变化

空白对照组、NC组及LncRNAGASL1组FN表达为100.00%、(103.60±9.35)%和(21.22±3.05)%,E-cad表达为(3.25±0.36)%、(5.26±0.68)%和(28.21±2.65)%。空白对照组和NC组无差异，与NC组比，LncRNAGASL1组FN表达下调(P<0.01),E-cad表达上调(P<0.01)。

四、宫颈癌及癌旁组织的LncRNAGASL1表达变化及与宫颈癌临床病理参数的关系

宫颈癌及癌旁组织的LncRNAGASL1表达为(0.98±0.15)和(1.23±0.11)，差异有统计学意义(P<0.01)。LncRNAGASL1表达与年龄无相关性(P>0.05)，肿瘤直径较大、FIGO分期较晚、分化程度较低和淋巴结转移患者LncRNAGASL1表达降低(P<0.05)，见表1。

表1LncRNAGASL1表达与宫颈癌临床病理参数的关系

讨论

本研究通过慢病毒转染法成功构建LncRNAGASL1过表达C-33A细胞，LncRNAGASL1过表达后细胞由纺锤形和梭型变为鹅卵石形，C-33A细胞增殖活力和侵袭能力均受LncRNAGASL1过表达影响而降低。研究显示，消耗LncRNAGASL1可减少乳腺癌细胞的生长，迁移和侵袭，敲击LncRNAGASL1可促进癌细胞的生长，促进癌细胞远处转移[4]。研究报道，丹参酮ⅡA处理后诱导食管癌细胞EC9706和KYSE70由纺锤状的间充质形态转变为上皮形态，细胞增殖和侵袭能力下降，细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymaltransformation,EMT)标志物E-cadherin增加，Snail-2、Vimentin和N-cadherin降低[5]。本研究过表达LncRNAGASL1可能抑制C-33A细胞EMT状态，LncRNAGASL1过表达后FN表达下调，E-cadherin表达上调，FN和E-cadherin是EMT标志物中的经典指标。Sung等[4]将食道鳞状上皮癌的EMT状态分为野生型(E-Cad+/FN-)、完全型(E-Cad-/FN+)、不完全型(E-Cad+/FN+)和空白型(E-Cad-/FN-)，完全型的总存活率及无病存活率最差，其次是不完全型，野生型较好。侵袭性乳腺癌的EMT多为野生型，而完全型和不完全型的总体存活率和无病存活率均低于野生型[6]。本研究C-33A接近完全型EMT表型，过表达LncRNAGASL1细胞转变为不完全型，细胞增殖和侵袭能力降低，提示LncRNAGASL1可影响C-33A细胞EMT表型，改变细胞增殖和侵袭能力。与癌旁组织比，宫颈癌的LncRNAGASL1表达降低，肿瘤直径较大、FIGO分期较晚、分化程度较低和淋巴结转移患者LncRNAGASL1表达降低。

本研究发现LncRNAGASL1能将C-33A细胞从完全型EMT表型转变为不完全型EMT表型，降低细胞增殖和侵袭能力，临床研究也显示宫颈癌LncRNAGASL1表达与肿瘤直径、FIGO分期、分化程度和淋巴结转移等病理参数相关，为进一步研究LncRNAGASL1提供了理论支持。

文章来源：鲍红玉,张凯英,黄广翅,周小飞,张桂芳.LncRNAGASL1对宫颈癌细胞增殖的影响及其机制探讨[J].中国妇产科临床杂志,2021,22(05):458-