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探讨HLA-DQB1-AS1调控miRNA-205-5p表达对宫颈癌增殖、迁徙和侵袭的影响

2021-09-14 163 上传者：管理员

摘要：目的探讨长链非编码RNAHLA-DQB1-AS1调控miRNA-205-5p表达对宫颈癌增殖、迁移和侵袭中的影响。方法检测HLA-DQB1-AS1在宫颈癌及其对应宫颈癌旁组织、H8(人宫颈永生化上皮细胞系)及Siha和Caski(人子宫颈癌细胞系)中的表达;预测并验证HLA-DQB1-AS1、miRNA-205-5p和HLA-DQB1的调控关系;检测Siha和Caski细胞的迁移、侵袭及增殖能力;分析调控HLA-DQB1-AS1表达对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的影响。结果HLA-DQB1-AS1在宫颈癌细胞和组织中表达量上调;HLA-DQB1-AS1靶向结合miRNA-205-5p,且HLA-DQB1是miRNA-205-5p的靶基因,HLA-DQB1-AS1通过miRNA-205-5p促进HLA-DQB1的表达;体内外实验证实HLA-DQB1-AS1过表达促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移能力(P<0.05),反之起抑制作用;(均P<0.05)。结论HLA-DQB1-AS1在宫颈癌组织细胞中高表达。HLA-DQB1-AS1通过负调控miRNA-205-5p促进HLA-DQB1表达,促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移。

关键词：
HLA-DQB1-AS1
miRNA-205-5p
侵袭
增殖
宫颈癌
转移
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宫颈癌是发病率高的恶性肿瘤[1]。长链非编码RNA(long-chainnon-codingRNA,lncRNA)作为抑制肿瘤及其致癌基因的重要调控靶点[2]，在宫颈癌的意义研究不足，如HLA-DQB1-AS1。人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DQB1等位基因多态性被证实参与人类肿瘤[3]。本文拟分析HLA-DQB1-AS1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨HLA-DQB1-AS1调控上述生物学行为的机制，为宫颈癌的诊断和治疗提供可能的生物学靶点。

材料和方法

一、临床资料

随机选取就诊于苏州大学附属第二医院39例宫颈癌患者的新鲜宫颈鳞状细胞癌组织与相应癌旁组织（距离肿瘤边缘>2cm），宫颈癌分期采用2018年版国际妇产科联盟（FIGO）的标准，纳入对象均经术中病理切片证实为宫颈鳞癌，且临床分期均不超过ⅡA期，排除标准：(1)近期妊娠史；(2)宫颈手术史；(3)术后接受放疗及化疗。组织标本处理后存放于液氮中保存。本研究经苏州大学医学伦理委员会批准，患者入院前均签署知情同意书。

二、实验材料

4～6周龄SPF级雌性BALB/C(nu/nu）裸鼠购自上海实验动物中心。Siha和Caski（人子宫颈癌细胞系）及H8（人宫颈永生化上皮细胞系）购自上海复旦大学细胞库。RPMI-1640细胞培养液等购自美国Gibco公司。RNA定量试剂盒购自日本Takara公司。TRizol,Lipofectamine2000,RNA逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根公司。CCK-8检测试剂盒购于日本同仁化学研究所，细胞凋亡检测试剂盒购自上海欣博盛生物公司。

三、方法

(1)细胞培养和转染：培养细胞融合度超过85%时洗涤消化离心（1000rpm/min×5min）后重悬，进行转染，将实验组和对照组质粒分别与mimics,miRNA-205-5p,miRNA-205-5pinhibitor、renilla共同转染Siha及Caski细胞系，renilla是内参。培养48h，检测各指标的变化情况；(2)生物信息学分析：软件预测与HLA-DQB1-AS1的3’-UTR互补的miRNA-205-5p;(3)总RNA的提取：提取组织和细胞中总RNA逆转录构建cDNA文库。HLA-DQB1-AS1引物序列：上游5’-CTCTTGAGCAGTCTGAGGAAAGA-3’，下游5’-CATGGCCAGCTGCGTCTA-3’。每个样品设3个复孔并重复检测3次；(4)双荧光素酶报告基因检测实验：将含miRNA-205-5p与HLA-DQB1的结合位片段的HLA-DQB1序列构入质粒pGL3-3’-UTR中，得到质粒HLA-DQB1-U1。将结合位点突变（Mut,CTGAGGCCAC-ATGCAGTCCA）并构建突变质粒HLA-DQB1-U1-Mut，转染到Siha或Caski细胞中测定光素酶活性；(5)筛选稳转细胞系；(6)MTT法测定细胞增殖：将过表达、低表达和对照三组Siha和Caski细胞接种于96孔中，培养48h，计算细胞增殖倍数；(7)Transwell检测细胞迁移与侵袭：将三组Siha和Caski细胞加入Transwell小室上层48h，取出上室用固定后擦除内层细胞，下层膜细胞用结晶紫染液染色。镜下4个视野取平均数；(8)宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型：取三组Siha和Caski细胞细胞悬液，经皮下注射到裸小鼠背上进行成瘤实验，观察肿瘤生长。当肿瘤明显可见时，隔日测量肿瘤直径，计算肿瘤体积=L×W2×0.5(L：长；W：宽）。

四、统计学方法

采用SPSS22.0软件包进行统计学处理。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、HLA-DQB1-AS1在宫颈癌组织及Siha和Caski宫颈癌细胞中表达

与癌旁正常组织相比，HLA-DQB1-AS1在宫颈癌组织中表达量显著上升（1.49±0.12）倍，差异有统计学意义（P<0.05）。

二、HLA-DQB1-AS1-miRNA-205-5p-HLA-DQB1靶向关联分析

构建野生型HLA-DQB1-U1及突变型HLA-DQB1-U1-Mut荧光素酶报告基因质粒。miRNA-205-5p显著降低HLA-DQB1荧光素酶活性，敲低miRNA-205-5p表达能够显著消除miRNA-205-5p对于HLA-DQB1的抑制作用(P<0.05）。与HLA-DQB1-AS1过表达组相比，miRNA-205-5p显著降低对照组细胞荧光素酶活性（P<0.05），而敲低miRNA-205-5p显著消除miRNA-205-5p细胞荧光素酶活性，过表达组的细胞荧光素酶活性则没有明显影响。

三、HLA-DQB1-AS1促进Siha和Caski细胞增殖

接种后48h开始，过表达组吸光度高于对照组Siha和Caski细胞（P<0.05）；低表达组细胞吸光度显著低于对照组Siha和Caski细胞（P<0.05）。

四、HLA-DQB1-AS1对体外宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的影响

过表达组与对照组细胞相比，穿透基质胶与小室底部滤膜的数量明显增加（P<0.05），低表达组与对照组相比，穿透基质胶与小室底部滤膜的数量明显减少（P<0.05）。

五、HLA-DQB1-AS1与人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤体积

第5周过表达Siha组肿瘤体积显著高于对照组（P<0.05），过表达Caski组高于对照组（P<0.05），而低表达Siha组肿瘤体积显著小于对照组（P<0.05），低表达Caski组显著小于对照组（P<0.05）。

讨论

宫颈癌诊疗缺乏早期发现、监测病情以及个体化治疗的可靠指标。LncRNA是长度大于200nt的一类非编码RNA，其在基因的转录翻译、细胞分化、细胞周期调控、表观遗传、个体发育等多个方面发挥着重要的调控作用，广泛参与机体的生理和病理过程，与癌症预后也有一定的相关性[4,5]。但lncRNA在宫颈癌中的调控路径和作用机制研究尚处于初级阶段，结论尚少。HLA-DQB1-AS1是一种新发现的lncRNA，参与调控胃癌及实体肿瘤的生物学行为，但HLA-DQB1-AS1在宫颈癌中的研究在国内外均缺乏。本研究发现与人类宫颈旁正常组织及正常宫颈细胞相比，HLA-DQB1-AS1在宫颈癌组织及宫颈癌细胞Siha和Caski中表达显著上调，后续的体内外研究证实其参与调控宫颈癌细胞的生物学行为。

LncRNA在肿瘤中可能通过“海绵作用”序列互补结合特定miRNA，调控miRNA靶基因的表达[6,7]。人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA)-DQB1所存在的等位基因多态性被证实与人类多种恶性肿瘤的发生发展相关联[3]。本研究发现HLA-DQB1-AS1-miRNA-205-5p-HLA-DQB1可能是参与宫颈癌的重要机制。本实验发现高表达HLA-DQB1-AS1内源性竞争性结合miRNA-205-5p，解除miRNA-205-5p对靶基因HLA-DQB1的抑制作用，促进细胞功能活跃。低表达HLA-DQB1-AS1增加了miRNA-205-5p对HLA-DQB1的抑制作用，导致细胞功能抑制。据此我们得出结论HLA-DQB1-AS1与基因HLA-DQB1在miRNA-205-5p上有相同的结合位点，HLA-DQB1-AS1靶向吸附miRNA-205-5p调控HLA-DQB1转录影响宫颈癌细胞生物学行为。体外实验证实上调HLA-DQB1-AS1的表达时，宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力明显增强。而敲低HLA-DQB1-AS1的表达，宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力受到抑制。体内实验证实，过表达HLA-DQB1-AS1小鼠成瘤体积增加；HLA-DQB1-AS1促进宫颈癌细胞增殖和肿瘤生长，增强细胞的侵袭及迁移能力。

HLA-DQB1-AS1-miRNA-205-5p-HLA-DQB1通路在宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移中发挥重要作用，课题组推测HLA-DQB1-AS1是潜在的宫颈癌发生发展预警因子，为宫颈癌预测、早期诊断及靶向治疗提供可能的生物标记靶点。

参考文献:

[1]刘金阳,权丽丽.同步放化疗治疗复发性宫颈癌的疗效及安全性[J].癌症进展，2021,19(7):737-740.DO110.11877/|jissn.1672-1535.2021.19.07.22

[2张若,张鸢.IncRNABRE-AS1调控Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌SHa细胞增殖、侵袭和凋亡的实验研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(5):577-586.DOI:10.3969/j.issn.1000-484X.2021.05.012

[4]张智勇,贺海斌,裘丰.LncRNAANCR在胃癌患者肿瘤组织中表达的临床意义及其生物学效应研究[J.中华内分泌外科杂志,2021,15(2):158-163.DOI:10.3760/cma.j.cn.115807-20200913-00277

文章来源：马晴晴,杨主娟,郭亮生,朱维培,陶晓敏.探讨HLA-DQB1-AS1调控miRNA-205-5p表达对宫颈癌增殖、迁徙和侵袭的影响[J].中国妇产科临床杂志,2021,22(05):461-463.