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宫颈癌患者癌组织中lncRNA HOXA-AS2表达对患者免疫指标水平和不良生存结局影响

2023-07-20 66 上传者：管理员

摘要：分析宫颈癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)HOXA簇反义RNA 2(HOXA-AS2)表达对患者免疫指标水平和预后的影响。方法选取2016年1月至2017年5月于当阳市人民医院确诊为宫颈癌的95例患者作为宫颈癌(CC)组，同期40例子宫肌瘤患者作为对照组。比较两组组织(对照组为宫颈组织，CC组为宫颈癌组织)及血清HOXA-AS2水平差异。采用Pearson相关分析HOXA-AS2与宫颈癌患者免疫指标水平的相关性。Cox回归模型分析宫颈癌患者不良生存结局的影响因素。结果与对照组比较，CC组组织及血清HOXA-AS2水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。CC组患者CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比、免疫抑制酸性蛋白(IAP)水平均高于对照组，而CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴细胞百分比均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织HOXA-AS2水平与IAP、CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比呈正相关(r=0.617、0.593、0.528,P<0.05),与CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴细胞百分比呈负相关(r=-0.506、-0.539、-0.482,P<0.05)。分化程度为低分化、发生淋巴结转移、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期及HOXA-AS2高表达是宫颈癌患者不良生存结局的危险因素(P<0.05)。结论 HOXA-AS2在宫颈癌中表达水平升高，其与宫颈癌患者免疫指标水平密切相关，是宫颈癌患者不良生存结局的危险因素。

关键词：
HOXA簇反义RNA 2
宫颈癌
宫颈癌手术
长链非编码RNA
预后
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宫颈癌是女性常见的妇科恶性肿瘤之一，是女性恶性肿瘤死亡的第四大原因，2020年的全球新发病例、死亡病例分别为604 127例、341 831例，占女性癌症相关死亡的7.7%[1]。尽管临床上宫颈癌手术、放疗、化疗等治疗技术取得较大进展，但患者5年生存率仍相对较低[2]。此外，我国年轻女性宫颈癌患病率仍在持续增加，严重威胁女性生命健康[3]。故分析宫颈癌发生、发展的分子机制，对于寻找有效治疗靶点，改善预后有重要意义。研究显示，长链非编码RNA(lncRNA)可以在多个层面对基因表达进行调控，参与细胞生物学活动、免疫反应及耐药性产生等过程，与宫颈癌发生、发展及预后相关[4]。近期发现，HOXA簇反义RNA 2(HOXA-AS2)在宫颈癌组织中表达上调，发挥促癌作用，沉默HOXA-AS2能够抑制肿瘤细胞增殖[5]。基于此，本研究分析宫颈癌患者血清与癌组织中HOXA-AS2水平，探究癌组织HOXA-AS2表达与免疫指标、不良生存结局的关系。

1、资料与方法

1.1一般资料

将2016年1月至2017年5月在当阳市人民医院确诊的95例宫颈癌患者纳入研究作为CC组，宫颈癌患者均符合宫颈癌相关诊断标准[6];根据FIGO分期标准：Ⅰ～Ⅱ期56例(58.95%),Ⅲ～Ⅳ期39例(41.05%);鳞癌52例(54.74%),腺癌33例(34.74%),鳞腺癌10例(10.53%);低分化20例(21.05%),中、高分化75例(78.95%);肿瘤最大径<3 cm 44例(46.32%),≥3 cm 51例(53.68%)。纳入标准：(1)年龄20～65岁，随访资料完整；(2)无妇科相关内分泌疾病史；(3)术前结合临床检查由两位副主任医师以上的病理老师阅片并明确诊断为宫颈癌，术后经病理及免疫组化检查确诊。排除标准：(1)病理诊断不明确者；(2)有损害机体免疫功能的手术史如淋巴结切除术等；(3)术前已经行放疗或化疗；(4)合并急慢性炎症；(5)伴其他恶性肿瘤；(6)术前合并血液系统疾病；(7)随访时失联。另外，选取同期因子宫肌瘤行切除子宫的40例患者作为对照组，对照组与CC组一般资料比较见表1。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

表1两组一般资料比较

1.2方法

1.2.1标本收集

两组患者均在入院后次日采集空腹静脉血，一份离心后获得上层血清，另一份采用无菌肝素抗凝，贮存在-80℃;所有新鲜组织(对照组为宫颈组织，CC组为宫颈癌组织)均由手术或活检获取，采用液氮研磨法得到粉末样品，同样贮存在-80℃备用。

1.2.2实时荧光定量PCR检测组织及血清中HOXA-AS2水平

取贮存的组织或血清样品，采用总RNA抽提试剂盒(货号：R1200)得到RNA,然后在Aurora-900超微量分光光度计(创誉科技公司)上检测RNA浓度及质量；取2μg RNA利用反转录试剂盒(货号：RP1105)得到cDNA;取cDNA按照2×SYBR Green PCR Mastermix(货号：SR1110)配制反应体系，将混合体系置于ABI 7500荧光定量PCR仪中扩增。设置程序如下：热启动95℃5 min;变性95℃15 s,退火60℃30 s,循环40次。试剂盒均由索莱宝公司提供。采用2-ΔΔCt法计算HOXA-AS2的相对表达水平。引物序列设计见表2。

1.2.3免疫指标的检测

使用流式细胞仪(型号：NovoCyte Quanteon,安捷伦)检测T淋巴细胞亚群(CD3+CD4+CD8+T淋巴细胞)、自然杀伤细胞(CD16+CD56+);采用合肥莱尔生物公司的酶联免疫吸附试剂盒检测血清免疫抑制酸性蛋白(IAP)水平(货号：LE-H1551),按照说明书操作。

表2 HOXA-AS2及内参基因GAPDH引物序列

1.3随访

从宫颈癌患者接受治疗第1天开始，于2022年5月截止，以随访结束或患者死亡为终点事件。采用门诊随访、电话方式进行，记录患者生存状态、术后恢复情况等。

1.4统计学处理

采用SPSS25.0统计软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x¯±s表示，两组间比较采用独立样本t检验和配对t检验。计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Cox回归模型进行预后影响因素分析。Pearson相关分析癌组织HOXA-AS2与CD8+T淋巴细胞百分比及IAP等免疫指标的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组间组织及血清中HOXA-AS2水平比较

CC组组织及血清标本HOXA-AS2水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);CC组组织与血清HOXA-AS2水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3两组间组织及血清中HOXA-AS2表达水平比较(x¯±s)

2.2两组免疫指标水平比较

与对照组相比，CC组患者血清IAP水平、CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比增高，而CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴细胞百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4两组血清免疫指标水平比较(x¯±s)

2.3宫颈癌患者癌组织中HOXA-AS2表达水平与免疫指标的相关性

癌组织HOXA-AS2表达水平与IAP、CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比呈正相关(r分别为0.617、0.593、0.528,P分别为0.006、0.015、0.023),与CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值呈负相关(r分别为-0.506、-0.482、-0.539,P分别为0.014、0.028、0.009)。

2.4宫颈癌患者生存预后的影响因素

随访12～60个月，中位随访时间22个月，共死亡41例。以患者死亡为因变量，将年龄、体重指数、吸烟史、饮酒史、家族史、分化程度、病理类型、肿瘤最大径、淋巴结转移、FIGO分期及HOXA-AS2表达水平作为自变量，纳入Cox模型进行单因素分析，并将结果中差异有统计学意义的变量引入Cox回归模型进行多因素分析，结果发现分化程度为低分化、发生淋巴结转移、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期及HOXA-AS2高表达是导致患者死亡(不良生存结局)的危险因素(P<0.05)。见表5～7。

表5变量赋值

表6 Cox单因素分析

表7 Cox多因素分析

3、讨论

根据癌细胞类型，由宫颈外鳞状细胞引起的为鳞癌，占宫颈癌的80%,由宫颈内腺细胞引起的为腺癌，占10%～20%[7,8]。中国女性约占全球女性的1/5,加之人口结构、生育模式、年龄结构和生活方式转变，导致中国女性宫颈癌的发病率、死亡率呈现上升趋势[9]。手术、放疗、化疗、抗血管生成药物、免疫疗法等已经应用于临床，但对于转移性或晚期宫颈癌治疗效果有限，预后仍较差。lncRNA通过多种机制在肿瘤细胞异常增殖、迁移、上皮间充质转化(EMT)、耐药及血管生成等过程中发挥关键作用[8]。此外，lncRNA能够调控免疫反应相关基因表达，参与先天和适应性细胞类型(T细胞、CD8+T细胞)的分化和功能调节[10]。因此，探讨lncRNA与宫颈癌免疫指标和预后的相关性，有助于为该病的分子机制解析、靶向治疗以及化学耐药性提供新思路。

lncRNA广泛表达于人体各器官中，不具备编码蛋白质能力，但能够通过表观遗传等调控靶基因表达，影响细胞信号通路，参与宫颈癌细胞的凋亡、EMT、耐药性产生等过程，影响宫颈癌预后[11]。HOXA-AS2基因长度为1 048个碱基，位于HOXA簇HOXA3和HOXA4之间的7号染色体，已有研究证实HOXA-AS2在肝癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、口腔鳞状细胞癌等中表达上调，具有促进肿瘤细胞增殖功能[12]。例如，子宫内膜癌组织中HOXA-AS2表达水平升高，上调的HOXA-AS2通过miR-302C-3P介导的ZFX促进了Ⅰ型子宫内膜癌细胞侵袭、增殖，增加S期细胞比例[13]。有研究报道，HOXA-AS2能够调控miR-509-3p表达，导致BTN3A1水平增加，促进宫颈癌进展[5]。另有学者发现，HOXA-AS2通过调控Notch途径在宫颈癌发展中起促癌作用，抑制HOXA-AS2表达则显著抑制了宫颈癌细胞增殖、迁移[2]。本研究中HOXA-AS2在CC组血清及癌组织中表达水平升高，说明HOXA-AS2在宫颈癌组织及血清中表达趋势具有一致性，HOXA-AS2与宫颈癌密切相关。但HOXA-AS2在宫颈癌中的异常表达与免疫指标的关系及预后价值尚缺少研究探讨。ZHONG等[14]研究发现，HOXA-AS2通过与miR302-a结合，促进KDM2A/JAG1表达，从而促进胶质瘤中Treg细胞增殖，增强免疫耐受性。免疫细胞可以通过影响肿瘤进展而成为免疫治疗和临床结局的影响因素，CD8+T细胞和自然杀伤细胞可以通过CXCL9-11/CXCR3信号通路募集，从而通过一种旁分泌形式抑制肿瘤[15]。本研究CC组血清IAP水平、CD8+T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比增加，而CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值均显著降低，与任晓红等[16]研究一致；同时，癌组织HOXA-AS2表达水平与CD8+T淋巴细胞百分比、IAP、自然杀伤细胞百分比呈正相关，与CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值、CD4+T淋巴细胞百分比呈负相关，提示宫颈癌中HOXA-AS2的异常表达能够抑制CD3+、CD4+T淋巴细胞活化，但会促进CD8+T淋巴细胞活化。

HOXA-AS2的高表达与多种恶性肿瘤如乳腺癌、视网膜母细胞瘤患者的不良预后密切相关。例如，关于急性髓系白血病研究显示，血浆HOXA-AS2水平在预后危险度分层高危者中表达上调，HOXA-AS2表达水平≥3.54是急性髓系白血病患者预后不良的危险因素[17]。HOXA-AS2在乳腺癌中表达上调，并与淋巴结转移、远处转移、TNM分期和术后生存情况密切相关[18]。平俐等[19]发现，HOXA-AS2高表达患者的3年总生存率低于低表达组，其高表达是视网膜母细胞瘤患儿预后不良的独立危险因素。为了进一步探讨HOXA-AS2在宫颈癌预后判断中的价值，本研究通过Cox风险模型分析宫颈癌患者不良生存结局的影响因素，发现癌组织HOXA-AS2高表达是不良生存结局的危险因素，因此HOXA-AS2有希望成为宫颈癌患者不良生存结局预测的标志物。

综上所述，宫颈癌患者血清及癌组织中HOXA-AS2表达水平升高，与患者免疫指标水平存在相关性，而且是影响患者不良生存结局的危险因素。但本研究病例纳入来源单一、例数少，HOXA-AS2与宫颈癌患者不良生存结局关系仍需要多中心大样本来进一步验证。

参考文献:

[3]吴雪萍,陈雪峰,闫鼎鼎.言颈癌患者直系年轻女性家属HPV疫苗接种现状调查及相关因素分析[J].护士进修杂志,2021,36(14);1339-1341.

[4]张丽,罗晶,张义晗,等.长链非编码RNA在宫颈癌中的表达及预后价值[J].中国现代医学杂志,2020,30(19):15-22.

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)[J/CD].中国医学前沿杂志(电子版),2013,1(8):10.

[11]吴茵,赵兰静,潘杰.长链非编码RNA在宫颈癌发生发展及预后中作用的研究进展[J].中国肿瘤临床与康复,2020,27(10):1278-1280.

基金资助:湖北省自然科学基金项目(WJ2017S006);

文章来源:徐晶,向圣友,王燕等.宫颈癌患者癌组织中lncRNA HOXA-AS2表达对患者免疫指标水平和不良生存结局的影响[J].国际检验医学杂志,2023,44(13):1609-1613.