宫颈癌是全球女性第二大最常见的妇科肿瘤，发病率高，时刻威胁着女性健康[1]。据世界卫生组织统计，全球宫颈癌年新发病例约52.8万，年死亡病例约26.6万，其中发展中国家占85%[2]。国家癌症中心统计数据显示，我国年新增宫颈癌病例约9.89万，年死亡病例约3.05万[3]。早期发现和治疗宫颈癌前病变可有效中断肿瘤进展，降低侵袭性癌的发生率和死亡率。目前，宫颈癌前病变的筛查和诊断手段仍存在不足之处。人乳头瘤病毒(HPV)检测灵敏度高，特异度低，无法准确判断HPV的感染阶段[4]。宫颈细胞学检查灵敏度低，假阴性率高，诊断结果受主观因素影响大[5]。当前宫颈上皮内瘤变的病理检测采用苏木精曙红(HE)染色，该方法诊断一致性低，会导致很大一部分患者接受不必要的宫颈诊疗[6]。p16INK4a是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，在HPV E7蛋白致癌级联反应的作用下过表达，是近几年国内外的研究热点，是当前最具有发展前景的宫颈肿瘤生物监测标志物之一[7,8,9]。相较于以上检查手段，p16INK4a免疫染色的灵敏度和特异度性高，诊断一致性高，有助于实现宫颈癌前病变的准确分级，对p16INK4a免疫染色的深入研究可提高宫颈癌前病变筛查和诊断的精准性。本文介绍了宫颈癌前病变的筛查及诊断现状，系统阐述了p16INK4a免疫染色在宫颈癌前病变筛查及诊断方面的研究进展，同时指出了p16INK4a免疫染色在研究及应用方面亟待解决的一些问题。

1、宫颈癌前病变的筛查及诊断现状

1.1宫颈癌前病变的筛查现状

目前，筛查宫颈癌前病变的主要方法是HPV检测和宫颈细胞学检查。从病原学角度看，临床主要应用HPV检测对宫颈癌前病变进行筛查。HPV是宫颈恶性肿瘤最重要的致病因素。据统计，80%的妇女在生命的某个阶段会感染HPV病毒，但这些感染大多是短暂的，90%的HPV病毒感染可以在两年内通过人体免疫消除。部分HPV感染会发展为持续性病毒感染，HPV将病毒基因整合到宿主基因组中导致宫颈恶性肿瘤，其中16型/18型是HPV病毒的主要致癌基因型[10]。Murphy等[4]研究显示：HPV检测宫颈高级别病变的灵敏度和特异度分别为88.2%和57.8%。HPV检测不能确定HPV的感染阶段，在检出高级别宫颈病变的同时，也会检出一过性HPV感染人群，这一缺陷使得HPV检测应用于宫颈癌筛查的价值有限。上述研究表明，HPV检测灵敏度高，但其特异度低，无法准确判断HPV的感染阶段，会导致不必要的阴道镜转诊及过度治疗。

从细胞学角度看，临床主要应用宫颈细胞学检查对宫颈癌前病变进行筛查。细胞学检查是根据宫颈脱落细胞的形态学改变得出诊断结果。宫颈细胞学检查对于宫颈高级别病变的灵敏度低，假阳性率高，在肿瘤转化的早期阶段，诊断者很难将病变细胞与化生、衰老及萎缩等与肿瘤转化无关的细胞区分开来，此外，宫颈细胞学检查结果受主观因素的影响较大[5]。Katki等[11]研究显示细胞学检查阴性患者3年后发生CIN3+的风险高达17%。相关研究指出[12],细胞学检查结果为不明意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)进展为CIN2+的风险为7%～12%,这类不明确的诊断一定程度上会导致高级别宫颈病变的漏诊，高达30%的宫颈浸润性癌患者至少有一次细胞学检查结果呈阴性[13]。上述研究表明，宫颈细胞学检查的敏感度低，假阴性率高，诊断结果受主观因素影响大，用于宫颈癌前病变筛查易延误病人的最佳治疗时机。

宫颈癌筛查结果异常的患者需转诊至阴道镜检查。阴道镜检查是结合醋酸染色、碘试验，对宫颈可疑病变部位进行病理活检。考虑到HPV16/18型阳性感染者恶性肿瘤的进展风险高，美国食品药品监督管理局(FDA)建议所有HPV16/18型阳性女性直接转诊至阴道镜检查，并联合细胞学检查对其余12种HPV分型阳性的女性进行分流。由于不同年龄阶段对HPV病毒的免疫力不同，美国阴道镜检查和宫颈病理协会建议，将宫颈细胞学检查作为30岁以下女性的首选筛查方案，将HPV和宫颈细胞学联合检测作为30～65岁女性的首选宫颈癌筛查方案，联合检测可同时提高对高级别宫颈病变的灵敏度和特异度[14],但有研究[4,15]表明，尽管联合检测提高了筛查的准确性，仍有60%～80%转诊至阴道镜检查的患者接受了不必要的创伤性检查，可见，提高宫颈癌前病变筛查的准确性、合理性，避免漏诊的同时减少过度诊疗是目前亟待解决的问题。

1.2宫颈癌前病变的诊断现状

目前，临床及大部分研究仍沿用HE染色的宫颈上皮内瘤变(CIN)三级分类法对宫颈癌前病变进行病理分级。病理学家根据细胞异型程度和宫颈上皮受累范围的不同，将宫颈癌前病变由轻到重依次诊断：CIN1、CIN2及CIN3,每个阶段所对应的治疗方案不同。CIN1为低级别宫颈上皮内瘤变，是良性的病理表现，57%～60%的CIN1病变会自然消退，22%～32%的CIN1病变会保持不变，仅有1%～11%的CIN1病变会向更高级别的病变进展。CIN3为宫颈高级别上皮内瘤变，进展为宫颈浸润性癌的可能性大，仅有33%的CIN3会被机体免疫清除，至少12%会发展成宫颈浸润性癌，其中在1年内发展成浸润性癌的比例为0.2%。相比之下，CIN2的生物学特性更接近CIN1,超过40%的CIN2患者会自然消退。CIN2发展为CIN3的概率约为20%,而CIN2发展为宫颈癌的概率仅为5%[16,17,18]。考虑到CIN2/3的恶性潜能，对宫颈癌前病变进行准确分级和精准治疗显得极为重要。

美国阴道镜和宫颈病理学协会发布指南，推荐CIN1患者定期随访观察，CIN2和CIN3患者接受手术治疗，以避免宫颈癌前病变进展为浸润性癌。目前，临床上建议CIN2/3患者行宫颈环形电切术/宫颈冷刀锥切术。这两种治疗方案均可有效治疗宫颈癌前病变，避免其发展为浸润性病变，但可能会导致一些术后并发症的出现，如术后创面愈合不良、出血、粘连、狭窄及出现赘生物等。此外，对于有生育需求的女性来说，切除部分宫颈组织会导致流产、早产及胎膜早破等的概率增加。CIN2的生物学行为更接近CIN1,而进展为宫颈浸润性癌的CIN2不到5%。假设对宫颈活检结果为CIN2的患者均采取手术治疗，很大一部分患者会接受不必要的损伤和过度治疗。在诊断方面，由于人工阅片，受主观因素制约，HE染色的CIN病理诊断方法诊断一致性较差(K值：0.45～0.50),易造成漏诊或误诊，诊断的精准性有待提高[6]。上述研究表明，对高级别宫颈病变采取更精准的检测技术手段，实现精准分级并进行针对性手术治疗具有重要意义。

2、HPV E7蛋白使p16INK4a过表达的机制

p16INK4a是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，可减缓细胞从DNA合成前期(G1期)到细胞分裂期(S期)的进程，在细胞周期调控中发挥重要作用。转录因子E2F可与未磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)结合。细胞周期蛋白D依赖性激酶4/6复合物(CDK 4/6)可使pRB磷酸化，与E2F分离，游离的E2F进入细胞核使靶向基因转录，加速细胞从G1期向S期转化，促进细胞DNA的合成。p16INK4a可灭活CDK 4/6,抑制pRB磷酸化，E2F与未磷酸化的pRB相结合，游离E2F减少，致使细胞周期停滞。HPV的持续感染会使病毒基因整合到宿主基因组中，产生的致癌蛋白E7会与E2F竞争结合未磷酸化的pRB,导致游离E2F增多，从而激活细胞周期，使细胞从G1期转变为S期。功能失活的pRB通过负反馈调节机制，使p16INK4a出现过表达，在同一细胞中，E7蛋白使pRB介导的细胞周期调控功能失活，尽管p16INK4a出现过表达，表达E7蛋白的细胞仍会继续增殖。随着时间推移，大量p16INK4a积聚在细胞核与细胞质中，可通过免疫染色检测出来[19]。p16INK4a过表达与E7致癌蛋白的产生密切相关，表明病毒基因已整合到了宿主细胞基因组中代表具有进展风险的持续性HPV感染，意味着致癌级联反应的开始。

针对肿瘤生物标志物p16INK4a的研究是近几年国内外的热点话题，p16INK4a被认为是当前最具有发展前景的宫颈肿瘤生物监测标志物之一。从HPV导致肿瘤转化的分子机制层面来看，p16INK4a是一项可靠的肿瘤生物监测标志物，在宫颈癌前病变筛查及诊断方面发展前景广阔，p16INK4a免疫染色的应用有望改善宫颈癌前病变的筛查及诊断现状。

3、p16INK4a免疫细胞化学染色应用于宫颈癌前病变筛查的研究进展

对宫颈脱落细胞进行免疫细胞化学染色可判断宫颈细胞中p16INK4a的表达情况。Nasioutziki等[20]研究显示，与HPV检测相比，p16INK4a免疫细胞化学染色对高级别宫颈上皮内瘤变的特异度更高，而两者的灵敏度相似。Wu等[21]研究显示，p16INK4a免疫细胞化学染色比宫颈细胞学检查更为客观，诊断性能更高。与HPV检测和宫颈细胞学检查相比，p16INK4a免疫细胞化学染色的灵敏度和特异度更高，对高级别宫颈癌前病变的诊断性能更高已成为研究界共识。当前研究的主要趋势是探究其应用于宫颈癌筛查及分流的临床价值。Carozzi等[22]经过3年的随访得出，与HPV检测和细胞学检查联合筛查相比，HPV检测和p16INK4a免疫细胞化学检测联合筛查对高级别宫颈病变的诊断准确性更高。Peeters等[7]Meta分析结果显示，与HPV检测相比，p16INK4a免疫细胞化学检测对细胞学检查结果为ASCUS和LISL中的CIN3+特异度更高，但灵敏度相对较低。Cuzick等[8]研究结果显示，HPV检测阳性且p16INK4a免疫细胞化学染色、细胞学检查结果均为阴性的患者进展为CIN2+、CIN3+的风险分别为0.2%和0.3%,3年后的发病风险分别为2.9%和0.9%。将细胞学检测与p16INK4a检测相结合对HPV阳性患者进行分流可在保持高灵敏度的同时可降低阴道镜转诊率及重复检查率。但现有研究仍未解决联合筛查及分流方案模糊不清，对不同年龄阶段的女性是否应采取不同的宫颈癌筛查策略，p16INK4a免疫细胞化学染色随访时间间隔不明确等问题，仍需大样本分析及长期跟踪随访。综上所述，p16INK4a免疫细胞化学染色对诊断高级别宫颈上皮内瘤变的灵敏度和特异度高，推荐用于宫颈癌前病变筛查，将其与现有筛查手段进行联合检测前景广阔。在诊断方面，对宫颈脱落细胞进行p16INK4a免疫细胞化学染色，当细胞核呈棕黄色或细胞质与细胞核均呈棕黄色时，单个细胞染色结果判定为阳性。Tsoumpou等[23]研究指出，随着细胞学检查异常程度的增加，宫颈细胞过表达p16INK4a的比例也在增加。在正常细胞涂片中，只有12%的p16 INK4a染色结果为阳性，而细胞学检查结果为ASCUS和LSIL,HSIL的染色阳性比例分别为45%,89%。在正常情况下，宫颈上皮化生或萎缩的鳞状细胞也表达p16INK4a,对宫颈脱落细胞进行p16INK4a染色有时会出现假阳性。为解决上述缺陷，Sahebali等[24]建议对p16INK4a染色阳性的细胞进行计数，并设置阳性阈值，以明确诊断结果。Wentzensen等[25]提出对p16INK4a染色阳性的细胞进行形态学评分，将核质比增加、染色质改变、细胞核形状改变及异核症作为p16INK4a染色阳性细胞的判断标准，建议将评分达2分以上的结果诊断为p16INK4a染色阳性，但是，理想的肿瘤生物标志物应尽量避免主观因素，进行形态学评分仍有不足之处。当前p16INK4a免疫细胞化学染色的诊断标准存在争议，尚未有研究对上述两种诊断标准进行对比分析或提出更好的诊断方案，p16INK4a免疫细胞化学染色仍缺乏统一的阳性阈值和判断标准，有待改良。

4、p16INK4a免疫组织化学染色应用于宫颈癌前病变诊断的研究进展

对宫颈活检组织进行免疫组织化学染色可判断宫颈组织中p16INK4a的表达情况。Galgano等[26]对1 455例宫颈活检组织进行了大规模检测，结果表明p16INK4a免疫组化染色在识别高级别宫颈病变方面有着很高的准确性。Castle等[9]研究指出：p16INK4a染色呈阴性的CIN2发展为浸润性癌的风险较低，生物学特性接近CIN1,而染色呈阳性的CIN2发展为浸润性癌的风险高，生物学特性接近CIN3。Miralpeix等[27]经过12个月的随访指出，所有p16INK4a阴性的CIN2宫颈病变均可自发性消退，p16INK4a免疫组化染色可用于指导CIN2患者的诊疗。美国阴道镜检查和宫颈病理学会发布的《宫颈癌筛查和癌前病变全球共识指南》提出，推荐p16INK4a为肿瘤生物监测标志物，肯定它在评估宫颈高级别病变中所表现出的灵敏度和特异度，建议将宫颈癌前病变的三级分类改为二级分类，用p16INK4a免疫组化染色分流CIN2患者，CIN1和p16INK4a阴性的CIN2患者归类至低级别宫颈上皮内瘤变(LSIL),报告为LSIL(CIN1)、LSIL(CIN2),p16INK4a阳性的CIN2以及CIN3患者归类至高级别宫颈上皮内瘤变(HSIL),报告为HSIL(CIN2)、HSIL(CIN3)[28]。世卫组织出版的《女性生殖器官肿瘤分类》第4版同样提议根据两级分类法对宫颈癌前病变进行命名。p16INK4a免疫组织化学染色可对宫颈癌前病变进行风险评估，可减少对高级别宫颈病变的漏诊和误诊，有助于实现宫颈癌前病变的准确分级和精准治疗。

在临床应用中，p16INK4a免疫组织化学染色缺乏统一的临床应用规范。Clark等[29]研究指出，不可在诊断明确的LSIL上过度使用p16INK4a免疫组化染色，不可利用p16INK4a免疫组化染色将可疑病变升级为HSIL。Sun等[30]研究表明部分p16INK4a染色阴性的CIN2宫颈组织仍存在明显的形态学改变，建议病理专家应在明确宫颈上皮内瘤变分级的前提下再去考虑是否使用p16INK4a免疫组化染色，宫颈病理诊断仍应以形态学为主要依据，避免过分依赖于p16INK4a染色。肛门下生殖道鳞状上皮病变术语指南指出，除某些特殊情况外，不建议将p16INK4a免疫组化染色作为良性、CIN1及CIN3宫颈组织的常规辅助检查手段[31]。提示，在临床中需规范应用p16INK4a免疫组化染色，宫颈病理诊断仍应以形态学为主要依据，避免过分依赖于p16INK4a染色，避免宫颈癌前病变的错诊、漏诊及过度诊疗。

在诊断方面，p16INK4a免疫组织化学染色的结果判定如下：弥漫性着色，点状、灶状着色，无着色。Von Knenbel Doeberitz等[19]以及Bergeron等[32]研究指出，宫颈鳞状上皮基底和副基底细胞层出现连续的棕黄色着色称为弥漫性着色，表明HPV转化性感染，高度怀疑恶性病变，染色结果判定为阳性；而出现单个细胞或小细胞簇p16INK4a染色阳性称为点状、灶状着色，常出现在化生或萎缩的鳞状上皮中，为良性表现，结果判定为阴性。Tsoumpou等[23]研究指出，仅2%的正常宫颈组织和38%的CIN1显示p16INK4a弥漫性着色，而CIN2和CIN3的p16INK4a弥漫性着色的比例分别为68%和82%。Stoler等[33]的研究指出，与单独应用HE染色相比，将p16INK4a免疫组织化学染色与HE染色联合对高级别宫颈病变进行诊断时，灵敏度提高了11.5%,特异度提高了3%,诊断一致性得到显著提高，然而，在Liu等[34]研究中，23%的CIN2宫颈组织p16INK4a染色结果为模棱两可的，建议将这类染色结果诊断为中等进展风险的CIN2病变，目前没有明确的临床处理方案，同时，p16INK4a免疫组织化学染色过程中存在多个技术变量，如抗体克隆、抗原提取等，均会影响检测结果。对p16INK4a免疫组织化学染色进行技术改良也是近几年的研究热点。斯坦福大学的Shain等[35]研究指出，p16抗体克隆16P04型和JC8型的诊断表现优于其他抗体克隆分型。上述研究表明，与传统的HE染色相比，p16INK4a免疫组化染色的诊断一致性更高，可直观、迅速及准确地提供答案，可提高癌前病变分级诊断的准确性，但p16INK4a免疫组织化学染色目前仍缺乏统一的技术规范及判定标准，有待改良。

5、结论与展望

p16INK4a作为一种客观的宫颈肿瘤生物监测标志物，近年来受到越来越多研究者的关注，表明人们已经从HPV导致肿瘤转化的分子机制层面去理解宫颈癌前病变。p16INK4a免疫染色可以作为宫颈癌前病变早期筛查、病变程度分级及治疗方案决策的重要检测手段，有助提高宫颈癌前病变筛查和诊疗的精准性，但是，目前仍存在一些不足之处，p16INK4a的准确性不能完全覆盖所有宫颈癌前病变，缺乏统一的技术操作流程，其诊断标准及临床处理规范仍存在一定争议等。为提高宫颈癌前病变筛查及诊断的准确率，制定规范的技术操作流程，明确统一的诊断标准及临床处理原则，进行大样本分析及长期跟踪随访是当前研究的主要趋势。总之，通过使用p16INK4a免疫染色可以更好地识别宫颈癌前病变，以期提出更积极有效的宫颈癌前病变筛查和诊断方案。

文章来源:兰晓卉,杨琦,崔满华.p16INK4a免疫染色应用于宫颈癌前病变的研究进展[J].中国妇幼保健,2023,38(16):3164-3168.DOI:10.