首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 宫颈癌论文 > miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的研究

miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的研究

2023-11-10 45 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的表达及与富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因1(LRIG1)的相互作用关系。方法实时定量PCR法检测HPV相关型宫颈腺癌组织中miR-183及LRIG1 mRNA的表达水平，Western blot法检测腺癌组织中LRIG1蛋白的表达。将miR-183 inhibitors(抑制物)、miR-183 mimics(模拟物)应用阳离子脂质体Lipofectamine TM2000转染至宫颈腺癌Hela细胞，并设立空白对照组、各自的阴性对照组，采用实时定量PCR法检测各组细胞中miR-183及LRIG1 mRNA的表达水平，Western blot法检测宫颈各组细胞中LRIG1蛋白的表达水平。结果 miR-183 mRNA在HPV相关型宫颈腺癌组织中的表达(0.91±0.10)明显高于正常宫颈组织(0.52±0.06),差异有统计学意义(P<0.05),而LRIG1的mRNA(0.56±0.03)及蛋白(0.09±0.02)表达水平均明显低于正常宫颈组织(mRNA:1.12±0.08,蛋白：0.25±0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(1.06±0.06)相比，转染miR-183抑制物的腺癌Hela细胞中miR-183 mRNA的表达水平(0.69±0.07)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05),转染miR-183抑制物的腺癌Hela细胞和对照组中，LRIG1 mRNA(分别为1.75±0.10、0.71±0.09)及其蛋白(分别为1.16±0.09、0.76±0.04)的表达水平反而均明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组(0.99±0.05)相比，转染miR-183模拟物的宫颈腺癌Hela细胞中miR-183 mRNA的表达水平(2.55±0.25)显著增高(P<0.05),转染miR-183模拟物的腺癌Hela细胞和对照组中LRIG1 mRNA(分别为0.40±0.05、0.75±0.08)及其蛋白(分别为0.32±0.01、0.76±0.06)表达水平反而均明显降低(P<0.05)。结论 miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中呈高表达，可能通过抑制LRIG1的表达参与宫颈腺癌的发生和发展。

关键词：
HPV
LRIG1
miR-183
宫颈癌
腺癌
加入收藏

宫颈癌的发生率位居全球女性恶性肿瘤第4位，近84%的病例发生于发展中国家[1]。在所有宫颈癌的组织学类型中，鳞状细胞癌和腺癌的总和超过90%,其中腺癌的发病率在近20年来呈不断上升趋势，且以HPV相关型腺癌最为常见，其中又以普通型占比最大。宫颈腺癌的普遍特点为难以早期发现和早期诊断，也易早期浸润、转移、放疗敏感性差、化疗易耐受和预后相对差[2]。因此，国内外学者对宫颈腺癌发生、发展的分子生物学机制进行深入研究，以期能发现早期诊断或靶向治疗的分子生物学靶点。宫颈腺癌的发生发展是一个复杂、连续、多步骤、多基因的调控过程，该过程涉及编码和非编码基因的异常表达、各基因相互作用及对各相关上下游基因蛋白的调控发生异常。我们选择普通型HPV相关型宫颈腺癌作为研究对象，前期研究发现，富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因-1(Leucine-rich repeat and immunoglobulin domain-containing protein 1,LRIG1)在正常宫颈组织、宫颈腺上皮内瘤变(cervical glandular intraepithelial neoplasia, CGIN)、HPV相关型宫颈腺癌中呈不断下降趋势，证实其在宫颈腺癌中发挥着抑癌基因作用，且与患者的各项临床病理参数有着密切联系，但具体作用机制仍需更深入的研究[3]。研究显示，在胶质母细胞瘤中LRIG1是MicroRNA-183(miR-183)的靶基因，通过使miR-183表达上调可以沉默LRIG1 mRNA的表达，从而使抑癌基因LRIG1蛋白水平表达下调，进而影响癌基因与抑癌基因的平衡，导致细胞增殖失衡，最终促进肿瘤的发生发展[4]。但尚无miR-183及LRIG1蛋白在普通型HPV相关型宫颈腺癌的相关研究报道。本研究主要探讨miR-183及LRIG1 基因蛋白在普通型HPV相关型宫颈腺癌中的表达及其与腺癌发生发展的相互关系及分子机制，旨在为普通型HPV相关型宫颈腺癌患者实现早期诊断、发现新治疗靶点提供新思路。

1、资料与方法

1.1 资料来源

收集2017年3月—2020年6月于太原市妇幼保健院手术切除的正常宫颈组织及普通型HPV相关型宫颈腺癌标本各10例，所有患者术前均未进行放化疗等任何治疗，术后病理诊断均经两名高级病理医师双盲法诊断。宫颈腺癌Hela细胞株购自中科院上海细胞库；培养基(索莱宝)、胎牛血清(cellmax);抗β-actin 抗体(普美生物);兔抗人多克隆LRIG1抗体(博士德);Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (thermo);miR183模拟物、抑制物及其各自的阴性对照(PPL);cDNA逆转录试剂盒(Thermo);TaKaRa转录试剂盒；辣根过氧化物酶标记羊抗兔和羊抗小鼠IgG(博士德);ECL化学发光试剂盒和BCA 蛋白浓度测定试剂盒(Thermo);本研究已通过医院伦理委员会批准，且患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

宫颈腺癌Hela细胞株接种于含10%胎牛血清(FBS)的培养基中，含双抗(青霉素与链霉素，不含丙酮酸钠),置于37°C含有5% CO2的细胞培养箱中。取对数生长期细胞以2.5×105/ml的密度接种于6孔板中，1～2天换1次液。培养后细胞密度不少于(5～10)×105个/ml。

1.2.2 转染和分组

待6孔培养板中细胞铺满70%～80%,采用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，转染步骤严格遵Lipofectamine 2000说明书分别转染miR-183模拟物组和抑制物组及其各自的阴性对照。转染分组：空白对照组、miR-183抑制物组、miR-183抑制物-NC组、miR-183模拟物组、miR-183模拟物-NC组。继续培养48 h后收集各组的RNA样本和蛋白样本。

1.2.3 Real-time PCR

提取正常宫颈组织、普通型HPV相关型宫颈腺癌组织及细胞总RNA,测定RNA浓度及纯度后逆转录成cDNA,按照TaKaRa TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ 20 μl体系试剂盒操作扩增，采用溶解曲线分析评价PCR结果的可靠性。PCR程序为 95℃ 15 s, 1个循环；95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 45个循环，制作溶解曲线。PCR结束后，在95℃变性1 min。然后冷却至55℃,使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持4 s, 同时读取吸光值。得到的结果用ΔΔCt 法分析，以β-actin为内参照，待测基因的相对表达量以2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=[Ct 目的基因(待测样品)-Ct内参(待测样品)]-[Ct目的基因(校正样品)- Ct内参(校正样品)]。miR-183 (forward) CTATGGCACTGGTAGAATTCACT miR-183 (reverse) TCGTATCCAGTGCAGGGTC LRIG 1 (forward) GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA LRIG 1 (reverse) CACCACCATCCTGCACCTCC β-actin (forward) CATGTACGTTGCTATCCAGGC β-actin (reverse) CTCCTTA ATGTCACGCACGAT。

1.2.4 Western blot法

取正常宫颈组织、普通型HPV相关型宫颈腺癌组织及转染后的细胞于1.5 ml无菌EP管内，按照1∶5体积加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=97∶3),提取总蛋白。离心(4 ℃,12 000 rpm, 15 min)取上清，BCA法蛋白总量，根据浓度加入适量上样缓冲液，充分混匀后，100 ℃沸水中加热10 min。上样，经SDS- PAGE 分离，以300 mA电转移至PVDF膜上，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h, TBST洗膜，10 min, 3次，然后分别加I抗LRIG1(1∶5 000)、β-actin(1∶4 000),4 ℃孵育过夜。次日回收Ⅰ抗，TBST洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶5 000),常温孵育1 h, 洗膜，放入ECL显影液(1∶1)中，避光混匀，Bio-rad凝胶成像仪曝光，Image Lab 5.1软件选中条带并分析灰度值，结果用目的蛋白与 β-actin相对表达量表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，所有实验数据都以均数±标准差(x¯±s)

表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 普通型HPV相关型宫颈腺癌组织中的mRNA和蛋白的表达

普通型HPV相关型宫颈腺癌组织中miR-183的mRNA表达水平显著高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(t=2.647,P=0.038);而LRIG1的mRNA与蛋白的表达水平均显著低于正常宫颈组织(t=6.324,P<0.000 1;t=3.668,P=0.035)。普通型HPV相关型宫颈腺癌组织中的mRNA和蛋白表达结果见表1。

表1 普通型HPV相关型宫颈腺癌组织中的mRNA和蛋白表达结果(x¯±s)

2.2 转染后宫颈腺癌Hela细胞中mRNA表达结果

与正常组相比，miR-183 抑制物组miR-183 mRNA显著降低(P<0.05),而LRIG1 mRNA的表达则显著升高(P<0.05);miR-183 模拟物组miR-183 mRNA显著升高(P<0.05),而LRIG1 mRNA的表达则显著降低(P<0.05)。miR-183 mRNA在miR-183 抑制物组较miR-183 抑制物-NC组表达显著降低(t=3.855,P=0.002 3),而LRIG1 mRNA的表达则显著升高(t=6.751,P<0.000 1)。miR-183 mRNA在miR-183 模拟物组较miR-183模拟物-NC组表达显著增高(t=7.783,P<0.000 1),而LRIG1 mRNA的表达则显著降低(t=3.623,P=0.004 0)。见表2。

表2 转染后宫颈腺癌Hela细胞中miR-183和LRIG1 mRNA表达水平(x¯±s)

2.3 转染后宫颈腺癌Hela细胞中LRIG1蛋白表达结果

LRIG1蛋白在miR-183抑制物组的表达水平为1.16±0.09,在miR-183抑制物-NC组、正常组的表达水平分别为0.76±0.04和0.63±0.07,差异有统计学意义(t=4.053,P=0.015 4)。LRIG1蛋白在miR-183模拟物组的表达水平为0.32±0.01,在miR-183模拟物-NC组、正常组的表达水平分别为0.76±0.06和0.63±0.07,差异有统计学意义(t=6.508,P=0.001 3)。

3、讨论

肿瘤的发生和发展是一个多因素多步骤的复杂过程，包括癌基因激活、抑癌基因失活等，随着分子生物学研究的深入，发现miRNAs与基因变化及肿瘤发生密切相关，因为它们在染色体上的位置非常接近肿瘤相关的基因组区域和染色体断点区域，因此，进一步了解肿瘤相关的miRNAs对于肿瘤的早期预测、诊断和治疗至关重要[5]。

研究表明，miRNA是一种小的内源性非编码单链RNA,在肿瘤生物学中参与了肿瘤的发生、细胞分化、肿瘤维持、远处转移和治疗耐药等过程，并作为肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点发挥着关键作用。miRNA能够完全或不完全地互补结合靶基因mRNA 3′端，从而降解、终止靶mRNA的翻译，调控靶基因的表达，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡。MiRNA-183家族是位于人类7号染色体的高度保守的miRNA家族，包括miRNA-183、miRNA-182和miRNA-96。研究结果表明，它们参与了膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的病理生理过程[6,7,8]。而miRNA-183的时空表达具有一定的组织特异性，在不同肿瘤中的表达具有差异性，并且调控基因的方式和作用各报道亦不一致。研究显示，miR-183在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等癌症中表达上调发挥致癌基因的作用，在骨肉瘤、黑色素瘤等癌症中表达下调发挥抗肿瘤基因的作用[8,9]。本研究显示，普通型HPV相关型宫颈腺癌组织miR-183的表达水平，与正常宫颈组织相比显著增高。

LRIG1是近期发现的一种肿瘤细胞抑制因子，通过负反馈调节酪氨酸激酶受体(EGFR)信号转导通路抑制细胞过度增殖及侵袭转移。它在多种恶性肿瘤患者的血清中均有不同程度减少，与肿瘤的发生发展密切相关，有望成为肿瘤诊断及治疗的潜在靶点[10,11]。多项研究证实，LRIG1在直肠癌、皮肤鳞状细胞癌、肺癌、神经胶质瘤等肿瘤组织及细胞内mRNA及蛋白的表达水平较正常组织均明显降低[12,13,14,15,16]。本研究显示，普通型HPV相关型宫颈腺癌组织LRIG1的mRNA及蛋白表达水平，与正常宫颈组织相比均显著降低，与项目前期研究结果一致，提示LRIG1可能成为普通型HPV相关型宫颈腺癌发生发展的新指标，但其分子机制有待更深入的研究。最新研究表明，在胶质瘤细胞中，LRIG1是miR-183直接作用的靶基因之一，miR-183可通过LRIG1调控EGFR/Akt 信号通路，提高肿瘤细胞活力并抑制肿瘤细胞凋亡[4]。为了确定miR-183在普通型HPV相关型宫颈腺癌中是否可调控LRIG1的表达，遂开展本课题研究。结果提示在腺癌中LRIG1可能为miR-183的作用靶点，miR-183的失调可能直接影响LRIG1的表达水平，同时结合前期研究结果[3],LRIG1被抑制或突变引起下游基因EGFR的表达缺失，增强了HPV相关型宫颈腺癌的细胞增殖，提示miR-183可能通过LRIG1调控EGFR进而参与影响腺癌的发生发展，反之抑制或敲除miR-183可能增强LRIG1的抑癌作用。同时miRNA的检测具有一定的敏感性和特异性，提示miR-183以及相关miRNA分子检测有可能成为更具潜能的宫颈腺癌筛查方法[17,18],这也将为普通型HPV相关型宫颈腺癌新驱动基因的发现、新辅助放化疗的敏感性以及靶向药物的精准化治疗提供新的思路和方向。

参考文献:

[3]王昱,邓洋,王秀梅,等.多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1及表皮生长因子受体在子宫颈腺癌组织中的表达及其意义[J].肿瘤研究与临床,2014,26(12):843-846.

[7]程勇,韩广森,顾焱晖,等.微小RNA-183对胃癌细胞增殖和迁移的影响及其分子机制[J].中华实验外科杂志,2020,37(3):405-407.

[8]王秀月,赵川,李文静,等.MicroRNA-183家族在肿瘤中的研究进展[J].中国肿瘤,2018,33(2):123-128.

[12]胡火军,黄益玲.LRIG基因家族与肿瘤的研究进展[J].重庆医学,2015,44(32):4589-4591.

基金资助:山西省科学技术厅重点研发计划(社会发展)项目(201903D321169);

文章来源:王昱,王秀梅,赵卉等.miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的表达及其对LRIG1蛋白的调节作用研究[J].中国妇幼保健,2023,38(22):4443-4446.