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HPV DNA与FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌筛查中的探讨

2023-11-10 65 上传者：管理员

摘要：目的探讨高危型HPV(hr-HPV)与FAM19A4基因启动子甲基化检测在筛查宫颈癌中的临床应用价值。方法选取2016—2018年在咸宁市中心医院就诊的210例患者拭子样本，其中正常及良性宫颈炎65例，CIN1 47例、CIN2 32例、CIN3 46例、宫颈癌20例。所有患者样本均接受高危型HPV检测及FAM19A4甲基化检测，对比单独HPV检测、单独甲基化检测以及两者联合检测在宫颈癌筛查中的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果在正常及良性宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌患者中，hr-HPV检测、FAM19A4基因启动子甲基化检测在不同程度宫颈病变患者阳性率均逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05); FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌早期病变诊断中的灵敏度低于hr-HPV检测，差异有统计学意义(P<0.05),特异度高于hr-HPV检测，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 hr-HPV检测具有高灵敏度和低特异度的特点，FAM19A4基因启动子甲基化具有低灵敏度和高特异度的特点，两者联合在宫颈癌早期病变筛查中具有较高的应用价值，可为宫颈癌早期病变筛查诊断提供参考依据，提高诊断准确性，改善疾病预后。

关键词：
DNA甲基化
FAM19A4
发病率
宫颈癌
高危型HPV
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子宫颈癌在全球范围内是排名第4位常见的恶性肿瘤，在女性的发病率仅次于乳腺癌。虽然宫颈癌筛查及人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)疫苗的使用使其发生率在发达国家地区显著下降，但在发展中国家仍有大部分发现于中晚期，5年生存率不及40%[1]。因此，能尽早发现宫颈病变，找有关宫颈癌早诊断、病情监测的新指标和新的、特异性强的宫颈癌靶点，对宫颈癌的预防和治疗有重要意义。2012年美国国立综合癌症网络(NCCN)公布的《宫颈癌筛查临床实验指南》已将HPV联合细胞学检查作为30～65 岁女性宫颈癌的筛查手段[2],近年来国内细胞学检测(thinprepcytologictest, TCT)和HPV联合检测手段筛查宫颈癌也得到大力推广。由于细胞学检测结果的判读较依赖于病理医师的经验和个人主观性，且宫颈癌早期由于病灶小或者病灶位置较偏，有误诊或漏检的可能性[3]。HPV DNA单独检测容易检出免疫应答自我清除病毒的感染者为阳性，导致过度治疗[4]。TCT联合HPV检测虽然提高了发现宫颈上皮内瘤样病变(CIN)2+以上病变的灵敏度，但特异性仍较低[5],尤其在年轻人群的筛查中较低，容易导致较高的假阳性率和阴道镜转诊率，增加患者的心理及医疗负担。近年来DNA甲基化与宫颈癌的关系成为研究热点，可作为宫颈癌早期诊断的特异性分子标志，能提高宫颈癌早期诊断的检出率[6,7]。研究表明，具有序列相似性的19 家族趋化因子(C-Cmotif)成员A4(family with sequence similarity 19 member A4,FAM19A4)可作为宫颈癌新型肿瘤标志物，可考虑作为HPV DNA检测的补充，提高临床检测特异度[8,9,10,11]。本研究基于荧光PCR平台，设计出可以检测HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82等18种高中危型别，同时可对HPV16型、HPV18型进行分型的多重荧光PCR检测试剂，以及针对FAM19A4启动子甲基化检测的双重荧光PCR检测试剂。采用两种试剂对210例不同程度宫颈病变的样本进行检测，得出结果后进行统计分析，探讨高危型HPV(hr-HPV)检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌筛查的价值。

1、资料与方法

1.1 资料来源

选择2016年5月—2018年5月于咸宁市中心医院妇科行宫颈病变检查的210例患者的宫颈细胞保存液作为研究对象进行回顾性分析，210例患者均经病理组织学确诊，其中正常及良性宫颈炎症65例，CIN1 47例、CIN2 32例、CIN3 46例、宫颈癌20例。不同宫颈病变组别平均年龄差异无统计学意义。引物探针于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hr-HPV检测

1.2.1.1 核酸的提取

利用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(湘长械备20150021号)提取宫颈细胞刷保存液中的DNA,试剂提取按照试剂盒的说明书进行操作，提取的核酸使用赛默飞世尔生产的Nanodrop 2000紫外-可见分光光度计进行浓度测量，DNA于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 多重荧光PCR检测

采用ABI7500型实时荧光定量PCR仪对宫颈细胞刷液中HPV DNA进行检测，以HPV31型、HPV16型、HPV18型目标靶区域的寡聚核苷酸片段，用1 ng/μl人基因组TE溶液稀释成阳性对照，以宫颈细胞保存液为阴性对照。反应体系共40 μl, 其中PCR反应液体积为35 μl, 主要包含10×Ex Taq Buffer4 μl/人份，各靶标序列引物0.08 μl/人份，各靶标序列探针0.03 μl/人份，内标引物0.02 μl/人份，内标探针0.03 μl/人份，靶标序列、内标引物及探针序列见表1。

表1 引物探针序列

Taq聚合酶0.2μl/人份以及UDG酶0.3 μl/人份；样本DNA体积5 μl。荧光PCR反应条件：第一步：50 ℃ 2 min, 95 ℃ 5 min, 1 cycle; 第二步：95℃15sec, 60℃ 30sec(read plate),40 cycles。荧光通道检测选择：选用FAM、HEX、ROX、CY5通道，各通道检测项为：FAM:26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型；VIC:16型；ROX:内标；CY5:18型。根据各个通道的Ct值报告结果，内标正常，检测有S型曲线，各通道Ct值≤38,则为相应通道的阳性，反之，则判为试剂盒检测范围内阴性。

1.2.2 甲基化检测

1.2.2.1 重亚硫酸盐的修饰

将1.2.1.1提取的DNA进行重亚硫酸氢盐处理，取20 μl提取后的DNA样本(根据浓度进行稀释，DNA总量不超过500 ng),利用EZ DNA Methylation-LightningTM Kit试剂盒(美国ZymoRe-search公司产品),按试剂盒说明书提供的方法操作。重亚硫酸盐修饰后的DNA立即用于荧光定量PCR检测，剩余样本储存在-20 ℃冰箱。

1.2.2.2 双重荧光PCR检测

采用ABI7500型实时荧光定量PCR仪对宫颈细胞刷保存液中DNA 的FAM19A4基因启动子甲基化进行检测，以宫颈癌宫颈细胞刷保存液中DNA、正常人宫颈细胞刷保存液DNA、双蒸水分别作为阳性对照、阴性对照和空白对照。FAM19A4基因启动子甲基化反应体系为40 μl, 其中PCR反应液体积为35 μl/人份，包含10×Ex Taq Buffer 4 μl/人份，上下游引物各0.08 μl/人份，探针0.03 μl/人份，内标引物0.08 μl/人份，内标探针0.03 μl/人份(靶标序列、内标引物及探针序列见表1),Taq酶0.2 μl/人份，肽核酸(peptide nucleic acids, PNA)0.2 μl/人份。PCR反应程序：第一步： 95 ℃ 5 min; 第二步：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s(采集荧光),40个循环。根据FAM19A4基因启动子甲基化扩增得到的Ct值与内参基因Ct值的差值(ΔCT)来判定样本甲基化程度，通过内参基因对样本质量进行质控，内参基因Ct值<32样本合格，ΔCT=CT靶基因-CT内参，ΔCT≤9判定为高风险，Ct值越小说明甲基化程度越高。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，以宫颈病理检查结果作为诊断金标准，分别计算HPV、FAM19A4基因启动子甲基化两种检测方法在宫颈癌及癌前病变筛查中的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。采用χ2 检验比较两种检测方法在不同宫颈癌病变程度样本检测有无差异性，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 荧光检测Hr-HPV

采用多重荧光PCR检测不同程度宫颈病变样本中的宫颈脱落细胞，正常及良性宫颈炎样本的阳性率为20.00%(13/65), CIN1期样本阳性率为42.55%(20/47),CIN2期样本阳性率为71.88%(23/32)、CIN3期样本阳性率84.78%(39/46),宫颈癌样本阳性率为95%(19/20)。其中19例宫颈癌样本中12例为HPV16型阳性占比63.16%,4例为HPV18型阳性占比21.05%,3例为其他HPV型别阳性。Hr-HPV检测在不同程度宫颈病变患者阳性率均逐渐增加，差异有统计学意义(χ2=67.99,P<0.01)。针对≥CIN2水平，Hr-HPV检测的临床灵敏度为82.65%,特异度为70.54%,阳性预测值为71.05%,阴性预测值为82.29%。见表2。

表2 Hr-HPV与FAM19A4基因甲基化检测不同程度宫颈病变样本结果[例(%)]

2.2 FAM19A4基因启动子甲基化检测

对不同程度宫颈病变样本中的宫颈脱落细胞采用双重荧光PCR检测，正常及良性宫颈炎样本的阳性率为6.15%(4/65), CIN1期样本阳性率为19.15%(9/47),CIN2期样本阳性率为50%(16/32)、CIN3期样本阳性率71.74%(33/46),宫颈癌样本阳性率为95%(19/20)。FAM19A4基因启动子甲基化检测在不同程度宫颈病变患者阳性率均逐渐增加，差异有统计学意义(χ2=86.3,P<0.01)。针对≥CIN2水平FAM19A4基因启动子甲基化检测临床灵敏度为69.38%,检测临床特异度为88.39%,阳性预测值为83.95%,阴性预测值为76.74%。

2.3 Hr-HPV荧光检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测结果分析

Hr-HPV检测临床灵敏度优于FAM19A4基因启动子甲基化检测，两种方法的灵敏度差异有统计学意义(χ2=4.73,P<0.05)。FAM19A4基因启动子甲基化检测临床特异度优于Hr-HPV检测，两种方法的特异度差异有统计学意义(χ2=10.94,P<0.01)。研究中≥CIN2期的受试者样本为98例，其中Hr-HPV检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测均为阴性的为14例，占比14.29%(14/98),Hr-HPV检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测均为阳性的为65例，占比66.33%(65/98);研究中<CIN2期受试者样本为112例，其中Hr-HPV检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测均为阴性的为76例，占比67.85%(76/112),Hr-HPV检测与FAM19A4基因启动子甲基化检测均为阳性的为10例，占比8.93%(10/112)。

3、讨论

宫颈癌为女性常见的临床恶性肿瘤，是导致女性死亡的主要原因之一。近年来，宫颈癌患者有年轻化的趋势，及时发现、诊断、治疗可显著提高宫颈癌患者的治愈率，延长患者生存时间[12]。临床研究证实，持续性发生高危HPV感染在宫颈癌发展中具有重要作用，伴高危型HPV感染导致的宫颈癌患者高达90%,由于HPV感染导致的良性宫颈炎等检出率较高，Hr-HPV DNA单独检测时存在灵敏度高、特异度低等的不足，阳性的预测给患者造成很大的心理负担。近年来，研究发现联合DNA甲基化检测技术能提高诊断宫颈病变的特异度[13,14,15,16,17]。国内外已有研究发现在宫颈细胞中，FAM19A4基因甲基化能作为新型的肿瘤标记物，在高效鉴别宫颈癌与正常宫颈组织方面具有一定应用价值[18,19]。

本研究表明，Hr-HPV检测的灵敏度(82.65%)显著好于FAM19A4基因启动子甲基化检测(69.38%),FAM19A4基因启动子甲基化检测特异度(88.39%)显著好于Hr-HPV检测(70.54%),可以考虑联合检测，寻求对患者更有利的筛查方式。考虑到Hr-HPV检测耗费的时间及经济成本较小，所有样本均先行Hr-HPV检测，阳性样本再行FAM19A4基因启动子甲基化检测。基于本研究结果预测，当Hr-HPV检测阳性且FAM19A4基因启动子甲基化检测阳性时，检测临床特异度为91.07%(102/112),两者均为阳性患者可立即行阴道镜检测；当Hr-HPV检测阳性且FAM19A4基因启动子甲基化检测阴性时，灵敏度为66.33%(65/98),这种类型患者可按规律随访，必要时进行医疗干预。

FAM19A4基因启动子甲基化检测Hr-HPV阳性样本，与细胞学联合HPV检测相比，减少了对细胞学操作者的依赖，不需要额外取样，增加了临床结果的可靠性及临床的可操作性。Strooper等研究发现，FAM19A4基因启动子甲基化检测Hr-HPV阳性样本分流过程中，灵敏度不显著低于HPV16/18分型和细胞学联合检测，但特异度明显增高，可有效减少阴道镜转诊率[20]。此外，有研究发现，FAM19A4基因启动子甲基化与HPV16/18分型联合用于检测≥CIN3 或≥CIN2病变，虽较单纯甲基化检测降低了特异度，但显著增加了灵敏度[19]。本研究中Hr-HPV检测既能检出常见能引起宫颈癌的HPV型别，也可对两者常见的致癌高危型别进行分型，与FAM19A4基因启动子甲基化联合检测，结合宫颈癌临床判断，有望成为宫颈癌筛查的辅助手段，具有较高的临床价值。

参考文献:

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文章来源:陈辉,夏松柏,许丽媛等.HPV DNA与FAM19A4基因启动子甲基化检测在宫颈癌筛查中的应用探讨[J].中国妇幼保健,2023,38(22):4447-4451.