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山竹子素通过调控PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用

2023-12-13 84 上传者：管理员

摘要：目的:探讨山竹子素是否通过调控PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用。方法:Immunoblotting检测PTEN表达水平。利用CRISPR/Cas9技术建立PTEN敲除的宫颈癌细胞模型。CCK-8和EdU染色方法检测细胞生长和增殖。流式细胞术检测细胞凋亡水平。划痕实验检测细胞迁移。Transwell实验检测细胞侵袭。利用PTEN敲除宫颈癌细胞来构建荷瘤小鼠模型，检测山竹子素对肿瘤形成和生长的影响。免疫组化检测移植瘤组织中PTEN表达和Ki-67增殖水平。结果:山竹子素可以显著上调宫颈癌细胞中PTEN的蛋白表达水平(P<0.01)。转染Cas9-PTEN质粒至宫颈癌细胞中可以显著下调PTEN表达(P<0.01)。在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素可以显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡(P<0.01)。在PTEN敲除的宫颈癌细胞中，山竹子素则对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡，无明显影响(P>0.05)。PTEN敲除可阻断山竹子素对裸鼠体内异种移植瘤生长的抑制作用。结论:山竹子素通过调控PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用。

关键词：
CRISPR/Cas9
PTEN
宫颈癌
山竹子素
放化疗
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宫颈癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，是导致全球范围内女性癌症死亡的主要原因之一，近年来其发病率和死亡率均成上升趋势[1,2]。手术切除和临床放化疗是当前治疗宫颈癌的主要方法，但疗效却不尽人意[3]。从中草药中分离高效低毒的抗肿瘤活性的化合物，是肿瘤研究的一个热点，对宫颈癌的治疗具有非常重要的意义[4]。第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是一个公认的抑癌基因，其表达缺失与肿瘤的发生和进展密切相关[5]。增强PTEN的表达或活性可有效抑制宫颈癌的进展[6]。山竹子素(garcinol)是从藤黄果中提取的一种黄酮类化合物，具有广泛的抗癌活性[7]。本项目组既往研究结果已表明，山竹子素在宫颈癌中发挥显著的抑癌作用[8],但其具体的分子作用机制尚未明确。本项目主要探讨山竹子素是否通过调控PTEN发挥其抑癌作用。

1、材料和方法

1.1 材料

宫颈癌细胞株CaSki和C-33A购自武汉普诺赛公司；SPF级BALB/c裸鼠购自西安交通大学实验动物中心；山竹子素购自上海源叶公司；CRISPR/Cas9-PTEN质粒购自上海吉玛制药公司；CCK-8和EdU试剂盒购自上海碧云天公司；凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛公司；蛋白提取、蛋白定量和转染试剂盒购自北京全式金公司；兔抗人PTEN和Ki-67抗体和山羊抗兔二抗购自武汉三鹰公司。

1.2 方法

1.2.1 PTEN敲除细胞株构建

CaSki和C-33A细胞接种于24孔板，待细胞融合度达到80%,采用TransIntro EL转染试剂将CRISPR/Cas9-PTEN质粒转染到细胞。孵育培养72 h, 采用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞株。

1.2.2 Immunoblotting

裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转移到PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉封闭。加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗室温孵育。采用ECL显色，将膜置于成像仪中采集图像。

1.2.3 CCK-8实验

细胞接种于96孔培养板，过夜培养。将培养基更换为含有10 μmol/L山竹子素的新鲜培养基，继续培养48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h。用酶标仪测定450 nm波长处的光密度。

1.2.4 EdU实验

将EdU工作液加入细胞培养基，继续培养2 h。采用4%多聚甲醛固定细胞。采用0.3%Triton X-100透化细胞。加入EdU反应复合物，室温避光孵育。加入DAPI溶液复染细胞核。采用荧光显微镜检测和拍照。

1.2.5 流式细胞术

收集细胞，PBS洗涤，加入染色缓冲液重悬。加入Annexin V-APC 和7-AAD 染色液，室温避光孵育。反应完成后，立即采用流式细胞仪检测。

1.2.6 划痕实验

细胞接种于6孔板块，待细胞融合度达到90%以上，用20 μL的枪头在每孔中进行划痕。PBS洗涤，去除漂浮的细胞碎片，继续培养24 h。在0 h和24 h, 采用倒置显微镜拍照。

1.2.7 Transwell实验

收集细胞悬液加入到用Matrigel基质胶包被的Transwell小室。下室加入含20%胎牛血清的完全培养基。将细胞置于培养箱中孵育培养24 h。用棉签擦除上层残留的细胞，4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.1%结晶紫溶液对细胞染色。显微镜下拍照，随机选取3个视野，进行计数统计分析。

1.2.8 异种移植瘤实验

将20只裸鼠随机分为4组。取C-33A细胞，PBS重悬，用1 mL无菌注射器分别在每只小鼠右前肢腋部皮下注射细胞悬液。接种次日开始灌胃给药，1次/d, 共给药3周。测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积。实验结束后，采用安乐死方式处死小鼠，分离瘤块，称重拍照，并进行后续分析。

1.2.9 免疫组化实验

将瘤体组织进行固定和石蜡包埋，切成4 μm厚度的薄片。将切片贴附在载玻片的合适位置，进行烤片、脱蜡、复水、抗原修复和内源性过氧化物酶灭活等步骤。滴加山羊血清，室温封闭。滴加兔抗人Ki-67或PTEN抗体稀释液，4 ℃、湿盒中孵育过夜。PBS冲洗，滴加山羊抗兔二抗稀释液，37 ℃、孵育30 min。PBS冲洗，滴加DAB显色液。Harris苏木素复染5 min。切片脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察和采集图像。

1.3 统计学分析

采用统计学软件GraphPad Prism 8进行数据统计分析和作图。实验结果以平均值±标准差(ˉx±s)表示。两组实验结果比较采用独立样本t检验。多组实验结果比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 山竹子素上调宫颈癌细胞中PTEN蛋白表达水平

与0 μmol/L对照组相比，PTEN蛋白表达量在山竹子素处理的宫颈癌细胞中显著升高(P<0.01,图1)。

图1 山竹子素对宫颈癌细胞中PTEN蛋白表达水平的影响

2.2 构建PTEN稳定敲除细胞株

与野生型细胞相比，PTEN在CRISPR/Cas9-PTEN质粒转染的细胞中蛋白表达水平显著下降(P<0.01,图2)。

图2 PTEN在CRISPR/Cas9-PTEN质粒转染细胞中的蛋白表达水平

2.3 PTEN敲除阻断山竹子素对宫颈癌细胞生长和增殖的抑制作用

CCK-8实验结果显示，在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素显著抑制细胞生长(P<0.01);而在PTEN-KO宫颈癌细胞中，山竹子素对细胞生长无明显影响(P>0.05),见图3。EdU实验结果显示，在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素显著降低EdU阳性细胞的比例(P<0.01);而在PTEN-KO宫颈癌细胞中，山竹子素对EdU阳性细胞的比例无明显影响(P>0.05),见图4。

图3 PTEN敲除对山竹子素介导的宫颈癌细胞生长抑制作用的影响

图4 PTEN敲除对山竹子素介导的宫颈癌细胞增殖抑制作用的影响(EdU染色×200)

2.4 PTEN敲除阻断山竹子素对宫颈癌细胞凋亡的诱导作用

流式细胞术实验结果显示，在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素显著增加细胞凋亡(P<0.01);而在PTEN-KO宫颈癌细胞中，山竹子素对细胞凋亡无明显影响(P>0.05),见图5。

图5 PTEN敲除对山竹子素诱导的宫颈癌细胞凋亡的影响

2.5 PTEN敲除阻断山竹子素对宫颈癌细胞迁移和侵袭的抑制作用

划痕实验结果显示，在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素显著降低细胞的迁移能力(P<0.01);而在PTEN-KO宫颈癌细胞中，山竹子素对细胞迁移无明显影响(P>0.05),见图6。Transwell实验结果显示，在野生型宫颈癌细胞中，山竹子素显著抑制细胞的侵袭能力(P<0.01);而在PTEN-KO宫颈癌细胞中，山竹子素对细胞细胞侵袭无明显影响(P>0.05),见图7。

图6 PTEN敲除对山竹子素介导的宫颈癌细胞迁移抑制作用的影响

图7 PTEN敲除对山竹子素介导的宫颈癌细胞侵袭抑制作用的影响(结晶紫染色×200)

2.6 PTEN敲除阻断山竹子素对裸鼠异种移植瘤的抑癌作用

荷瘤小鼠实验结果显示，山竹子素显著抑制野生型C-33A细胞形成的移植瘤的生长(P<0.01),而对PTEN-KO细胞形成的移植瘤的生长无明显影响(P>0.05),见图8。山竹子素显著降低野生型细胞形成的移植瘤的重量(P<0.01),而对PTEN-KO细胞形成的移植瘤的重量无明显影响(P>0.05),见图9。免疫组化结果显示，山竹子素显著上调野生型细胞形成的移植瘤中PTEN的表达水平(P<0.01),而PTEN-KO细胞形成的移植瘤中PTEN表达水平较低且山竹子素对PTEN表达无明显影响(P>0.05),见图10。山竹子素显著降低野生型细胞形成的异种移植瘤中的Ki-67增殖指数(P<0.01),而对PTEN-KO细胞形成的异种移植瘤中的Ki-67增殖指数无明显影响(P>0.05),见图11。

图8 PTEN敲除和山竹子素对异种移植瘤生长的影响

图9 PTEN敲除和山竹子素对裸鼠体内异种移植瘤重量的影响

图10 PTEN在各组异种移植瘤中的表达水平(免疫组化染色×100)

图11 PTEN敲除和山竹子素对异种移植瘤Ki-67增殖指数的影响(免疫组化染色×100)

3、讨论

研究表明山竹子素可通过调控多种肿瘤相关的关键分子和信号通路，来发挥其抑癌作用[7]。据报道，山竹子素可通过下调p300蛋白和抑制TGF-β1信号通路来抑制食道癌的转移[9]。通过抑制Wnt和Notch信号通路，山竹子素可抑制癌症干细胞样表型的发展[10,11]。山竹子素通过下调PI3K/AKT信号通路在胃癌中发挥抑癌作用[12]。因此，山竹子素可能在不同的肿瘤中靶向不同的信号通路来发挥其抑癌作用。但是，对于山竹子素在宫颈癌中的分子作用机制，目前尚未明确。

PTEN是目前研究比较广泛的一个抑癌基因[13,14,15,16]。PTEN通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程，发挥其抑癌作用[17,18]。PTEN的表达缺失和活性降低，在宫颈癌中经常发生[6]。上调PTEN的表达有效抑制宫颈癌的进展。据报道，一些从中草药中提取的抗肿瘤化合物，可通过增强PTEN来发挥抑癌作用[19,20]。本研究探讨了山竹子素是否可通过增强PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用。研究结果发现，山竹子素可显著提高宫颈癌细胞中PTEN的表达水平，提示山竹子素的抗癌活性可能与上调PTEN有关。为了进一步验证这一结论，本研究构建了PTEN敲除的宫颈癌细胞模型，然后检测山竹子素对PTEN敲除细胞的抗癌效果。在野生型的宫颈癌细胞中，山竹子素显著抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移和侵袭，并且抑制裸鼠体内的异种移植瘤的生长。在PTEN敲除的宫颈癌细胞中，山竹子素对细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，都没有明显的作用。另外，山竹子素对PTEN敲除细胞形成的异种移植瘤的生长也无明显作用。这些结果表明，PTEN敲除可阻断山竹子素的抑癌作用。

综上所述，本研究证实了山竹子素通过上调PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用。山竹子素上调PTEN的表达水平，敲除PTEN则阻断山竹子素的抑癌作用。本研究为解释山竹子素的抗癌分子机制，提供了新的思路，为其在宫颈癌的临床治疗应用提供了一定的理论基础。

参考文献:

[8]柴园园,赵娟,杨婷,等.山竹子素在宫颈癌中的抗肿瘤活性探讨[J].现代肿瘤医学,2023,31(09):1632-1638.

[15]夏红蕾,顾立萍.ARID1A及PTEN在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性[J].现代肿瘤医学,2022,30(10):1772-1776.

[16]陈凯文,江莲,朱秀丽,等.PTEN和Beclin-1在儿童非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(9):1715-1720.

基金资助:西安交通大学第一附属医院科研发展基金(编号:2021ZXY-16);

文章来源:冯思芳,赵娟,杨婷等.山竹子素通过调控PTEN在宫颈癌中发挥抑癌作用[J].现代肿瘤医学,2024,32(02):234-240.