宫颈癌发病率在全球女性恶性肿瘤中居第4位，严重威胁女性健康，其发病率和病死率依据地区不同而呈现出明显的差异，其中绝大部分宫颈癌患者来自于发展中国家[1-3]。数据显示，2022年中国约有111 820例宫颈癌新发病例和61 579例宫颈癌死亡病例，发病率和病死率均高于世界平均水平[4]。目前手术及放化疗依然是宫颈癌的主要治疗方式，但是晚期宫颈癌患者预后差，复发和转移的风险较高，病死率居高不下[5-6]。因此，深入研究宫颈癌的分子机制，寻找新的治疗靶点，对于宫颈癌的个体化治疗以及预后改善具有重要的临床价值。纺锤体和动粒相关复合物亚基2(spindleandkinetochore-associatedcomplexsubunit2,SKA2)，也称FAM33A，定位于人类基因组的第17号染色体上，是一个编码蛋白的基因[7]。SKA2通过与其他SKA亚基（SKA1、SKA3）结合，组装成SKA蛋白复合体，从而稳定纺锤体的微管附着在染色体动粒上，确保染色体分离和分裂无误。有研究发现，SKA2基因下调可破坏纺锤体纤维的稳定性，减缓细胞周期的中期进展，从而参与细胞周期调控[8]。截至目前，在包括乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]、肺癌[11]、肝癌[12]等多种人类恶性肿瘤中均检测到SKA2异常表达，并通过不同机制调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等病理生理学过程，影响这些肿瘤的发生发展及患者的预后，但其在宫颈癌中的作用及潜在的分子机制尚不清楚。本研究使用在线工具和免疫组化SP法分析SKA2在宫颈癌中的表达、与临床病理特征的关系及其预后意义，并通过体外实验探究SKA2对宫颈癌细胞生物学行为的影响，以期为宫颈癌的靶向治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 主要材料

胎牛血清、DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胰酶消化液均购自美国Gibco公司；TRIzol裂解液、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、BCA试剂盒、脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒、CCK-8试剂、Transwell小室、基质胶均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；SKA2抗体购自英国Abcam公司；GAPDH抗体购自上海泊湾生物技术有限公司；SKA2及GAPDH引物、SKA2特异性siRNA siRNA-SKA2及阴性对照siRNA-NC均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，序列见表1。

表1 siRNA-SKA2及siRNA-NC序列

1.2 生物信息学分析

使用GEPIA数据库与UALCAN数据库分析多种恶性肿瘤组织（包括宫颈癌）以及正常样本中的SKA2 mRNA表达数据[13-14]。使用HPA数据库分析SKA2蛋白在宫颈癌组织和正常对照组织中的表达[15]。UALCAN数据库用于分析SKA2基因在宫颈癌组织中的mRNA表达及其与临床病理特征的关系。

1.3 组织样本及临床病理资料收集

收集2018年9月至2023年9月于我院经术后病理明确诊断为宫颈癌患者的肿瘤组织样本（232例）、因子宫平滑肌瘤行全子宫切除术患者的正常宫颈组织样本（20例），以及宫颈癌患者的临床病理资料。术前每位患者均签署知情同意书，同意将捐赠的组织用于本研究。本研究经我院伦理委员会批准(伦理批号：2024-1266)，实验方案按照《赫尔辛基宣言》的规定进行。

1.4 免疫组化SP法

组织样本采用石蜡包埋，切片，浸入柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH 6.0)，沸腾浴15 min；在3%H2O2中浸泡10 min，以抑制内源过氧化物酶；在37℃下山羊血清封闭20 min，加入SKA2抗体(1∶100)于4℃过夜，然后滴加二抗(1∶1 000)，室温轻摇孵育1 h,DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明，中性树胶封片，镜下观察。在光学显微镜下对组织切片计数5个视野，分别对阳性细胞数所占比例（1分为阳性染色细胞数≤10%;2分为阳性染色细胞数占>10%～<50%;3分为阳性细胞数≥50%）以及染色强度（0分为无阳性着色；1分为淡黄色；2分为浅褐色；3分为深褐色）进行评分，两项得分相乘，0分及1分为低表达，2分及以上为高表达。

1.5 细胞培养

人正常宫颈细胞（HcerEpic）和人宫颈癌细胞(HeLa、SiHa、CaSki、C-33A)购自中国科学院细胞库。将其培养于含10%胎牛血清、2%青-链霉素的培养基，置于37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培养。

1.6 siRNA转染SiHa细胞

将处于对数生长期的SiHa细胞接种于12孔板，使用LipofectamineTM2000脂质体将30 nmol/L的siRNA-SKA2、siRNA-NC转染至SiHa细胞，分别记为si-SKA2组、NC组，不做任何处理的SiHa细胞记为Control组。转染步骤严格按照转染试剂盒的说明书操作。36 h后验证其转染效果并进行后续实验。

1.7 RT-qPCR

TRIzol裂解液提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒进行逆转录。每组样品设置3个复孔，按PCR试剂盒说明书进行定量PCR检测。反应体系为20µL。扩增程序为：95℃预变性3 min;95℃变性5 s,60℃退火20 s，共40个循环。采用2-△△Ct法分析定量PCR的结果。SKA2和GAPDH引物见表2。

表2 SKA2及GAPDH引物序列

1.8 Western blot实验

RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并定量。取20µg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，电转30 min后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入稀释比例为1∶1 000的兔抗人SKA2一抗，在4℃下孵育过夜，洗膜；随后加入二抗，室温下轻摇1 h，洗膜；加入ECL反应液，在暗室显影和定影后扫描。以GAPDH作为参照。

1.9 CCK-8实验

将处于对数生长期的宫颈癌细胞接种至96孔板，每孔中加入10µL CCK-8试剂，于37℃孵育1 h后，使用酶标仪于450 nm波长下测定不同孵育时间（24 h、48 h、72 h）对应孔的光密度(optical density,OD)值，并绘制增殖曲线图。

1.1 0 Transwell实验

提前用基质胶包被Transwell小室上室，细胞饥饿12 h，以1.0×105个/孔的密度接种至上室，并向下室加入500µL的含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于细胞培养箱(37℃、5%CO2)静置培养48 h。取出小室，PBS洗2次后用甲醇固定膜底细胞10 min,0.1%结晶紫染色20 min，随机选取5个独立视野计数并分析。1.11细胞划痕实验

收集各组对数生长期的宫颈癌细胞，胰酶消化后离心，将单细胞悬液以700个/孔的密度接种于6孔板中，当细胞密度处于95%时，白色枪头垂直于6孔板，在每个孔中央画十字，PBS清洗划下的细胞。培养0 h、24 h、48 h，分别放置于倒置显微镜上拍照记录。使用Image J软件统计每个时间点划痕相对面积。

1.12数据统计

采用SPSS 27.0及Graphpadprism 10.0进行统计学分析并绘图。计数资料（分类变量）采用率（%）描述，组间比较采用χ2检验。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 SKA2基因在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达情况

GEPIA数据库分析结果显示，SKA2基因在宫颈癌组织中的表达水平显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1a、b。从HPA数据库中获取到的免疫组化染色数据显示，在宫颈癌组织中，SKA2蛋白呈阳性表达（呈棕褐色），其主要分布在肿瘤细胞的胞浆和胞核内(图1c)。RT-qPCR结果显示，相较于正常宫颈细胞，宫颈癌细胞中的SKA2 mRNA表达显著增加，其中SiHa细胞中SKA2表达水平最高，见图1d，故选择宫颈癌细胞SiHa作为后续研究的对象。进一步行免疫组化SP法检测，结果显示，相比正常宫颈组织，SKA2在宫颈癌组织中高表达，见图1e。

图1 SKA2基因的表达情况

2.2 SKA2表达与临床病理特征的相关性及预后价值分析

利用UALCAN数据库对SKA2基因在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的mRNA表达水平进行分析，结果显示其在宫颈癌组织中高表达（P<0.05），见图2a。分析SKA2基因与宫颈癌临床病理特征的关系，结果显示，SKA2在宫颈癌患者中的表达水平与肿瘤FIGO分期密切相关（P<0.05）；与正常宫颈组织相比，SKA2的mRNA表达水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期宫颈癌组织中均升高（P<0.05），见图2b。Kaplan-Meier生存分析显示，SKA2基因高表达的宫颈癌患者总生存期缩短（P<0.05），见图2c。在232例宫颈癌患者中，分析患者临床病理特征与SKA2基因表达的关系，结果同样显示，SKA2高表达与宫颈癌患者的FIGO分期相关（P<0.05），见表3。

图2 SKA2表达与临床病理特征的相关性

表3 232例宫颈癌患者的临床病理特征及SKA2的表达

2.3 SKA2敲低抑制宫颈癌细胞增殖

采用脂质体将siRNA-SKA2及siRNA-NC转染至SiHa细胞，36 h后进行Western blot和RT-qPCR验证，结果显示SKA2表达成功下调，见图3a、b。CCK-8实验结果显示，与Control组及NC组相比，si-SKA2组细胞增殖能力明显减弱（P<0.05），见图3c。

2.4 SKA2敲低抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭

Transwell侵袭实验显示，与Control组及NC组相比，si-SKA2组宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力明显减弱；细胞划痕实验进一步证实，si-SKA2组细胞伤口距离相较Control组及NC组更宽（P<0.05），细胞的迁移能力下降，见图4。

3、讨论

宫颈癌作为全球女性第四大致命性恶性肿瘤，显著影响着全世界女性患者的健康和生活质量。尽管诊断和治疗方式不断进步，但因耐药、转移和复发而死亡的患者数仍较多[16]。因此，探索和开发宫颈癌的特异性预后标志物一直是当前的研究热点，对提高患者的生存率及改善患者预后具有重要意义。在癌症领域，基因表达的微妙平衡往往决定了细胞的命运。许多细胞周期相关基因的表达在肿瘤中失调，可能是药物治疗的潜在靶点[17-19]。

SKA2是一个与细胞有丝分裂密切相关的基因，主要职能是维持有丝分裂中期赤道板的稳定，及时关闭纺锤体检测点，进而确保细胞有丝分裂的顺利完成。在核膜破裂后，SKA2聚集于纺锤体微管和动粒，协助染色体分离，通过解偶联聚合的方式改善微球沿微管运动，有助于细胞进入有丝分裂后期，对细胞周期的调节起着关键作用[20]。近年来，SKA2在多种癌症中的重要作用已逐渐明晰。Ren等[9]发现SKA2在乳腺癌组织中表达升高，加重肿瘤恶性表型，可成为乳腺癌潜在的治疗靶点；李鑫等[10]发现在骨肉瘤中SKA2也可通过调节上皮-间质转化相关蛋白的表达水平促进细胞侵袭和迁移；Xia等[11]发现SKA2异常表达与肺癌的不良预后相关，可通过SKA2-PDSS2转录调控轴来促进肺癌的进展；Jiang等[12]发现SKA2在肝细胞癌中高表达，且下调SKA2表达后可抑制肝细胞癌肿瘤细胞的增殖、侵袭，为开发新的肝细胞癌诊断和治疗策略提供参考。

图3 敲低SKA2对宫颈癌细胞SiHa的SKA2表达水平及增殖能力的影响

图4 敲低SKA2对宫颈癌细胞SiHa侵袭和迁移的影响

尽管上述多项研究发现SKA2在其他癌症类型中的高表达与恶性肿瘤的进展和不良预后相关，证实了SKA2作为促癌基因的广泛作用，但其在宫颈癌中的作用尚未被深入研究。本研究通过分析生物信息学数据库中的测序数据发现，宫颈癌细胞和组织中SKA2的mRNA与蛋白表达水平明显高于正常宫颈细胞和组织，且SKA2高表达与宫颈癌患者的FIGO分期相关，这一结果提示SKA2高表达可能促进了宫颈癌的肿瘤生长和扩散，导致患者的不良预后。本研究采用免疫组化SP法检测了232例宫颈癌组织及20例正常宫颈组织中SKA2蛋白的表达情况，并对232例入组患者的临床资料进行了回顾性分析，结果均显示宫颈癌组织中SKA2蛋白表达水平高于正常宫颈组织，其高表达与宫颈癌FIGO分期相关，这些结果进一步验证了SKA2在宫颈癌中的促癌作用。SKA2不仅影响细胞周期的有丝分裂，还能通过多种分子调控机制影响肿瘤的发生发展[21]。多项研究表明，SKA2促进了肿瘤的恶性表型[9-12]。为了更深入地探究SKA2在宫颈癌中的作用，本研究首先检测了SKA2在正常宫颈细胞（HcerEpic）和宫颈癌细胞（HeLa、Caski、SiHa和C-33A）中的表达，结果显示，相较于正常宫颈细胞，宫颈癌细胞中的SKA2 mRNA表达显著增加，我们选择表达水平相对较高的SiHa细胞系进行后续分析。采用RNA干扰技术对SKA2进行敲低，成功构建SKA2下调的SiHa细胞系。体外功能实验结果显示，SKA2表达降低能够显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这些研究结果支持了SKA2作为促癌基因，在宫颈癌中过表达并发挥致癌功能，影响患者预后的结论。

综上所述，SKA2在宫颈癌中高表达，能够促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并与患者的不良预后相关。SKA2可能为宫颈癌的治疗提供新的靶点和策略，然而本研究主要聚焦于体外实验，尚未在动物模型中进行体内验证，同时未对其潜在的分子机制进行深入研究，需在后续研究中继续完善。

参考文献:

[10]李鑫,王晓冬,童晓琼,等. SKA2基因通过EMT调节人骨肉瘤细胞侵袭和迁移[J].现代肿瘤医学,2022,30(6):986-991. doi:10. 3969/j. issn. 1672-4992. 2022. 06. 007.

[21]任舟辉,杨峂,王萍. SKA2在肿瘤发生发展中的作用及其调控机制[J].中国细胞生物学学报,2017,39(10):1363-1368. doi:10. 11844/cjcb. 2017. 10. 0121.

基金资助:山西省基础研究计划(202103021224352); 中央引导地方科技发展基金(YDZJSX2022B012);

文章来源:花震丹,郑佳慧,褚莹,等.SKA2对宫颈癌细胞增殖､迁移和侵袭的影响及其预后价值[J].局解手术学杂志,2024,33(08):664-669.