结核病(tuberculosis, TB)是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, Mtb)通过空气传播感染引起的一类慢性传染病[1]。据WHO发布《2021年全球结核病报告》显示，目前死于结核病的患者已高达150万人，死亡人数明显上升。结核病高负担国家数量多达30个，而我国结核病患者数量位居第二；2020年估算的结核病新发患者数为84.2万，其死亡率仅低于艾滋病[2]。结核病难以治疗和根除的障碍与结核分枝杆菌在宿主细胞内复杂的作用方式密切相关。卡介苗(BCG Vaccine)是迄今为止唯一被批准的预防疫苗，但其应用范围局限，在成人中对结核病的保护效力十分有限[3]。由于缺乏有效的疫苗、广泛的耐药结核分枝杆菌出现以及相关化疗药物的副作用，因此进一步研究宿主和分枝杆菌在免疫应答中的相互作用显得至关重要。

细胞焦亡(pyroptosis)是细胞死亡的一种新机制，又被称作“细胞炎性坏死”;由炎性半胱天冬酶(Caspase)-1/4/5/11诱导炎性细胞死亡中断入侵病原体的复制，其表现为细胞膜孔隙形成、膜破裂、细胞肿胀、细胞内容物释放。在细胞死亡过程中释放的因子，如白细胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-18,放大炎症效应并激活免疫反应[4]。Caspase家族和GSDMs蛋白家族是诱导细胞焦亡的主要形成途径。激活的Caspase切割GSDMs蛋白，释放其N端结构域，该结构域结合膜脂并在细胞膜上打孔，促进促炎介质IL-1β的释放，引发细胞炎性死亡[5]。目前，Mtb诱导细胞焦亡达到免疫逃避的机制尚不明确，而病原菌的表面蛋白是如何触发细胞焦亡的发生机制有待研究。

作为一种促炎性细胞死亡类型，细胞焦亡在抵抗病原体感染和消除内源性风险信号发挥关键作用。而Mtb感染过程中如何影响细胞焦亡机制仍不清楚。Qu等通过比较Mtb H37Rv基因组分析确定了100多个BCG缺失片段RDs(Regions of Deletion),并对RD区编码的蛋白中筛选并鉴定了巨噬细胞凋亡相关蛋白，发现了一种RD3编码的分泌蛋白Rv1579c[6]。进一步发现Rv1579c编码的Phage蛋白通过与细胞质RACK1蛋白的互作用诱导巨噬细胞的焦亡。EST12结合RACK1并启动NF-κB/AP1诱导的下游免疫信号通路NLRP3-caspase-1-GSDMD-IL-β的激活，促进巨噬细胞中结核分枝杆菌的体外清除。作为新发现的细胞焦亡蛋白，其生物学功能及蛋白间的相互作用亟待进一步挖掘。本研究对Rv1579c编码的Phage蛋白生物信息学分析其结构和功能预测[7],进一步发现结核分枝杆菌与宿主细胞之间的免疫机理，为结核的候选疫苗研发及其诊断靶标夯实理论基础。

1、材料和方法

1.1材料

结核分枝杆菌Rv1579c的序列信息从美国生物技术信息中心(NCBI)Gene数据库获取；Gene ID为886369,基因组序列为NC000962.3,其编码的Phage蛋白序列为NP216095.1。

1.2方法

1.2.1 Rv1579c基因序列及其开放阅读框分析。

从NCBI Gene数据库获取Rv1579c基因及氨基酸序列，在ORF Finde软件上输入Phage蛋白的氨基酸序列，分析其开放阅读框。

1.2.2 Phage蛋白的理化性质分析。

运用Expasy网站中提供ProtParam数据集预测分析Phage蛋白的分子式、分子质量、不稳定指数等一系列理化特性。

1.2.3 Phage蛋白的跨膜区、亲疏水性、信号肽、糖基化及磷酸化位点的预测分析。

应用TMHMM Server v. 2.0、ProtScale对Phage蛋白的跨膜区和亲疏水性分析；SignalP 4.0、NetGlycate 1.0 Server、NetPhos 3.1 Server对Phage蛋白的信号肽、糖基化和磷酸化位点进行预测。

1.2.4 Phage蛋白结构预测。

利用SOPMA分析Phage蛋白的二级结构，进一步通过SWISS-MODEL对Phage蛋白三级结构同源建模。

1.2.5 Phage蛋白的B细胞抗原表位分析。

在IEDB数据库网站上输入Phage蛋白氨基酸序列，分析其柔韧性(Karplus&Schulz)、抗原性(Kolaskar&. Tongaonkar)、抗原表面可及性(Emini)、亲水性(Parker)和氨基酸编码蛋白质的β转角(Chou&Fasman),选择上述评分均靠前的区域作为B细胞的候选表位。

1.2.6 Phage蛋白的Th细胞表位预测。

使用两种数据库SYFPEITHI和RANKPEP综合预测Phage蛋白的Th细胞表位。 选择7种HLA基因分型(HLA-DRE1*0101、0401、0701、0801、0901、1101、1501)预测Th细胞表位；筛选SYFPEITHI中分数>18分的氨基酸序列；选取RANKPEP中预测的HLA基因分型红色标记结果。同时，对二者数据库的预测结果进行汇总，筛选有共同集合的Th细胞表位。

1.2.7 Phage蛋白的细胞毒性T淋巴细胞表位预测。

Phage蛋白的细胞毒性T淋巴细胞表位联合SYFPEITHI、RANKPEP以及NetMHCpan三大数据库预测分析。

1.2.8 Rv1579c的同源性分析和进化树构建。

利用NCBI中的BLAST工具对Phage蛋白进行同源性分析。同时，运用UniProt蛋白数据库进行序列比对；针对同源性较高的细菌种属利用MEGA-X构建进化树。

1.2.9 Rv1579c蛋白的相互作用蛋白分析。

使用STRING数据库对Phage蛋白的相互作用蛋白预测分析。

2、结果

2.1 Rv1579c基因序列及其开放阅读框分析

Rv1579c基因(ID:886369)位于Mtb(H37Rv)基因组(NC000962.3)1783309～1783623区域，全长270 bp,含有多个开放阅读框；最长编码的蛋白序列为NP216095.1,含有104个氨基酸(见图1)。

2.2 Phage蛋白的理化性质分析

Phage蛋白分子式为C480H750N140O164S4,原子总数1 538,相对分子质量为11.234 31×103;消光系数为8 605,280nm处的吸光度为0.766,脂肪族氨基酸指数为77.02;由104个氨基酸构成，其中丙氨酸(Ala)占11.54%,天冬氨酸(Asp)占10.58%,异亮氨酸(Leu)占9.62%,甘氨酸(Gly)占7.69%。Phage蛋白带正电的残基(Arg+Lys)总数为7,带负电荷的残基(Asp+Glu)总数为18,理论等电点(pI)为4.31。而Phage蛋白不稳定性指数为42.81,表明其为不稳定蛋白。

2.3 Phage蛋白的亲疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化及磷酸化位点的预测分析

利用ProtScale分析Phage蛋白总亲水性为-0.500,预测为亲水性蛋白(见图2a),第22、23位氨基酸疏水性分数最高为1.433,第94位氨基酸亲水性分数最高为-2.511。运用TMHMM预测该蛋白存在的跨膜螺旋数量，其氨基酸残基未突破阈值线，不存在跨膜结构(见图2b);表明Phage蛋白属于非跨膜蛋白，定位在Mtb胞膜外细胞壁上。使用SignalP 4.0 Server软件进行Phage蛋白信号肽的预测及分析，结果表明不存在信号肽(见图2c)。前70个氨基酸中最大C评分在第35位氨基酸，评分为0.174;最大Y评分在第35位氨基酸，评分为0.189;最大S评分在第33位氨基酸，评分为0.385。其C、Y、S评分均小于阈值0.450,推测Phage蛋白无信号肽。NetPhos 3.1软件预测(见图2d)Phage蛋白有5个苏氨酸磷酸化位点、5个丝氨酸磷酸化位点和2个酪氨酸磷酸化位点；NetNGlycate1.0 Server预测Phage蛋白并无糖基化位点(见图2e)。NCBI数据库BLAST软件分析(见图2f),Phage蛋白有一个结构域，属于泛素结合(UBA)蛋白超家族。

图1Phage蛋白的开放阅读框分析

图2Phage蛋白的疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点及BLAST分析

a.Phage蛋白疏水性分析；b.Phage蛋白跨膜区分析；c.Phage蛋白信号肽预测；d.Phage蛋白磷酸化位点分析；e.Phage蛋白糖基化位点分析；f.Phage蛋白BLAST分析。

2.4 Phage蛋白二级和三级结构预测

在线分析软件SOPMA预测Phage蛋白的二级结构含有36个α-螺旋(Hh),占34.62%;17个β-折叠(Ee),占16.35 %;38个无规卷曲(Cc),占36.54%(见图3a)。Phage蛋白的三级结构模型利用SWISS-MODEL蛋白分析软件构建(见图3b);其中GMQE和QMEAN模型评分为0.59、0.73,表明构建三级结构模型质量较好。

图3Phage蛋白空间结构预测

a.Phage蛋白的二级结构预测；b.Phage蛋白的三级结构预测。

2.5 Phage蛋白抗原表位预测

抗原表位是抗原分子与抗体结合的特定区域，高特异性和强结合力是评价抗原分子的良好指标。通过IEDB在线软件对Phage蛋白的B细胞表位进行预测。柔韧性参数阈值以1.018为基线，柔韧性越强与抗体结合更有优势，更易形成抗原表位的区域。选择柔韧性>1.018的氨基酸片段，并根据Phage蛋白的6个方面(表面可及性、可塑性、β转角、线性表位、亲疏水性、抗原)进行功能筛选(见图4),将总得分≥0.8作为B细胞表位的阈值设置，最终共获得了6个优势B细胞表位，见表1。

2.6 Phage蛋白的细胞毒性T淋巴细胞抗原分析

细胞毒性T淋巴免疫治疗的细胞表位通常选用HLA-A2、HLA-A3、HLA-B7三类CTL细胞抗原表位，通过SYFPEITHI、RANKPEP以及NetMHCpan三种在线分析软件预测分析Phage蛋白CTL表位。其中分值高的CTL表位结果见表2和表3;三者数据库的综合预测结果显示该蛋白的CTL抗原表位在HLA-A2存在高特异性限制性位点表位，其推测候选CTL表位为LMHELAVQVV,位于第15～25号氨基酸。

图4Phage蛋白B细胞表位分析

表1 Phage蛋白B细胞抗原表位预测分析

表2 Phage蛋白细胞毒性T细胞抗原表位预测分析

表3 Phage蛋白细胞毒性T细胞抗原表位综合分析

2.7 Phage蛋白的Th细胞抗原表位分析

SYFPEITHI和RANKPEP两种在线数据库分析预测Phage蛋白的Th细胞抗原表位，结果见表4和表5。其中HLA-DRBl* 0801、HLA-DRB1* 0901并不存在Th细胞抗原表位，HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701和HLA-DRB1*1501表型具有共有的表位，其共同表位分布在42～50位、86～94位、67～75位。

2.8 Phage蛋白的同源性分析和进化树构建

通过NCBI的BLAST工具分析，Phage蛋白共有40个相似序列，其中有15个序列高度相似，均为结核杆菌属，与人类蛋白无同源性(见图5a)。UniProt数据库氨基酸序列比对结果：结核分枝杆菌(M.H37Rv)、dioxanotrophicus分枝杆菌(M. dioxanotrophicus)、万巴伦分枝杆菌(M. vanbaalenii)、阿雷尼单胞菌(A. oryziterrae)、青光霉菌(S. glauciniger)、脱硫杆菌(D.toluolca)、Steynii曲霉菌(A.steynii)的序列覆盖率区域100.0%、43.4%、32.1%、42.6%、35.1%、33.3%、41.7%。多重序列比对分析和系统进化树结果显示，Phage在分枝杆菌属中表达中特异性表达，属于结核分枝杆菌(M.H37Rv)特征性表面蛋白(见图5b)。同时，Phage蛋白与人类蛋白无同源性，独特的表位可以作为未来抗结核的候选疫苗和结核病的诊断靶标，为结核病的预防及治疗提供一定的价值。

表4 Phage蛋白Th细胞抗原表位预测分析

表5 Phage蛋白Th细胞抗原表位综合分析

图5Phage蛋白的同源性分析和进化树构建

2.9 Phage相互作用蛋白预测

经STRING数据库预测发现Phage蛋白与PanD(天门冬氨酸脱羧酶)、YidC(前蛋白转位酶)、CydA(氧化酶复合物)、Rv1825、Rv1566c等蛋白相互作用(见图6)。

图6Phage蛋白的相互作用蛋白

3、讨论

结核病仍然是全球公共卫生的严重威胁，目前为止总共150万人死亡。耐多药/耐药结核病的持续出现是导致结核病难以根除的重要原因。结核病耐药产生一方面是由于抗生素治疗不当产生，其次是耐药结核病患者携带的耐药结核菌传播感染导致[8]。随着检测手段和治疗范围覆盖的不断提升，结核耐药得到了一定的控制。据WHO统计，2020年检测到的耐药结核病患者总计157 903名，与2019年检测到的201 997名相比，这一数字大幅下降22%。然而，我们国家的结核病防控形势仍不容小觑。数据显示，全球每年耐药结核病的估计发病率与2020年接受治疗的人数之间的差距高达70%的国家中我国居首位。这警示着我国在结核病这一方面仍需加强预防和深入的研究，努力改善耐药结核病的检测和诊断以及获得治疗的机会[9]。

卡介苗是迄今为止唯一被批准的疫苗，是由牛分枝杆菌株制成的减毒活菌疫苗。针对儿童结核性脑膜炎或全身播散型肺结核具有预防作用，但是对成人预防结核病没有效果。为了进一步增强新生儿卡介苗驱动的先天免疫和适应性免疫，并更好地保护其免受成人肺结核的侵袭，接种亚群疫苗是目前预防结核病的新策略，即以Mtb抗原特异性显性毒力蛋白为目标，比如结核分枝杆菌分泌的早期靶抗原-6 (ESAT-6),作为重组减毒病毒或其他病原体载体[10]。这种卡介苗/亚群疫苗组合将增强抗结核的先天免疫和适应性免疫。最新证据表明，RDs可能编码对结核病免疫和发病机制重要的潜在的新的功能性抗原。例如，补充RD1、RD2或RD13编码的RD抗原可增强卡介苗对结核小鼠的保护作用[11-12]。

Phage蛋白是卡介苗缺失的并独特存在于M.tb H37Rv RD3编码区蛋白片段，由104个氨基酸构成，分子量大小12kDa。其中丙氨酸(11.54%)、天冬氨酸(10.58%)、异亮氨酸(9.62%)、甘氨酸(7.69%)的占比较高。理论等电点为4.31,带负电荷的残基(Asp+Glu)总数为18,带正电荷的残基(Arg+Lys)总数为7。Phage蛋白不稳定性指数为42.81,为不稳定蛋白。通过TMHMM、SignalP 4.0 Server分析预测Phage蛋白属于非跨膜蛋白，定位在Mtb胞膜外细胞壁，没有信号肽结构。磷酸化位点分析，其含有12个磷酸化位点，丝氨酸和苏氨酸预测分数较高。作为结核分枝杆菌表面的效应物，Phage蛋白可能参与宿主固有免疫监视途径的激活应答以及双向调节宿主的免疫功能。BLAST分析，Phage蛋白存在一个含有真核生物泛素化相关(UBA)结构域，Phage蛋白的Y80氨基酸能够与支架蛋白活化C激酶1受体(Receptor for Activated C Kinase 1,RACK1)相互作用[13],招募去泛素酶UCHL5促进NLRP3的K48连锁去泛素化，进而诱导巨噬细胞焦亡和免疫的形成[6]。

Phage蛋白的二级结构显示其α-螺旋(Hh)36个，占34.62%;β-折叠(Ee)17个，占16.35 %;无规卷曲(Cc)38个，占36.54%。三级结构模型中，Phage蛋白表征主要有3个α螺旋和2个β链。氨基酸序列分析表明，Phage蛋白包含ESAT-6分泌系统1 (ESAT-6 secrets1)/Ⅶ分泌(T7S)位点，其基序为Y80xxxD/E[14]。与ESX分泌系统蛋白具有典型的螺旋—螺旋结构不同，需要进一步研究确定Phage蛋白属于哪种分枝杆菌分泌系统[15]。STING数据库预测Phage与PanD(天门冬氨酸脱羧酶)、YidC(前蛋白转位酶)、CydA(氧化酶复合物)等蛋白相互作用。PanD蛋白是一类广泛参与结核分枝杆菌泛酸和CoA合成的代谢酶，其活性与吡嗪酰胺耐药密切相关；YidC和CydA蛋白参与呼吸代谢中的能量合成和传递。这提示Phage蛋白作为一种Mtb胞膜外蛋白，参与着结核分枝杆菌代谢合成过程，可能与结核分枝杆菌的耐药相关。同时，Phage蛋白含有多个细胞抗原表位，序列比对Phage蛋白与人类蛋白没有同源性，在结核分枝杆菌菌属中高度保守，其独特的表位和序列信息可以作为未来抗结核的候选疫苗和结核病的诊断靶标，为结核病的预防及治疗提供一定的价值。

细菌和宿主之间的相互作用导致了细菌克服宿主免疫细胞攻击和宿主细胞感知和启动抗M.tb反应的多种机制的演变，包括诱导宿主细胞死亡程序的能力，例如巨噬细胞焦亡[16]。Rv1579c所编码的Phage蛋白作为一种可以诱导细胞焦亡发生的分子，对于宿主防御感染和危险信号免疫反应至关重要。本研究通过生物信息学分析预测Phage蛋白的结构和功能，强调了Phage蛋白诱导的细胞焦亡在M.tb诱导的免疫中的关键作用，为结核病发生发展机制提供新的研究思路，将有助于开发有效的新型疫苗和早期诊断的新靶标。

参考文献:

[7]葛永飞,骆洁雅,叶子,等.基于生物信息学方法分析人CREB结合蛋白的结构与功能[J].生物信息学,2023,21(2):121-127.

[9]徐彩红,赵雁林.从《2020年全球结核病报告》看我国结核病防治工作[J].中华传染病杂志,2021,39(7):392-397.

基金资助:广东省深圳市科技创新计划基础研究(No.JCYJ20180305125647151);

文章来源:黄和明,张娟,李高驰,等.结核分枝杆菌Phage蛋白的抗原表位预测及生物信息学分析[J].医学理论与实践,2025,38(01):14-19.