结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)通过空气传播引起的传染病，是导致人类死亡最多的一种慢性传染病。2022年全球新发结核病患者1 060万，其中750万为确诊肺结核(pulmonary tuberculosis, PTB)患者，全球有1/4的人感染MTB并长期处于潜伏感染状态[1]。结核潜伏感染者(latent TB infection, LTBI)临床上没有结核病症状，病原学和影像学无活动结核病的证据，但这部分感染者在免疫力下降后可能发展成为PTB患者。T淋巴细胞在结核病的发生、发展中扮演着重要免疫角色，特别是CD4+记忆T细胞不仅参与细胞免疫应答，而且参与体液免疫的调节[2-3]。T细胞各亚群的平衡状态并不是恒定不变的，而是在一定状态下相互转化的稳态过程。初始T细胞(naive T cell, Tn)也称作未致敏T细胞，主要功能是识别抗原，并在周围微环境影响下分化成为效应T细胞、记忆T细胞或调节性细胞等。其中记忆T细胞表达CD45RO分子，能够维持机体的免疫记忆功能，对凋亡耐受性强[4]。进一步根据分布部位、表面标记、归巢受体和杀伤效应等不同，可将记忆T细胞划分为中心记忆T细胞(central memory T cell, Tcm)和效应记忆T细胞(effector memory T cell, Tem)2个亚群[5-7]。Tcm主要存在于淋巴器官(如扁桃体、骨髓和淋巴结),表面高表达CD45RO、CD197[又称CC趋化因子受体7(CCR7)]、CD62L等分子，在介导细胞免疫等过程中发挥了中心性的调节作用；Tem主要分布于非淋巴组织，可以通过血液和淋巴循环迁移到外周炎症部位并发挥效应功能。目前国内对CD4+记忆T细胞亚群在不同MTB感染人群表达差异的了解还有限，抗原类型、持续时间和炎症因子环境等可能都会影响CD4+记忆T细胞的分化和效应功能。本研究通过检测不同MTB感染人群血清中CD4+记忆T细胞亚群及炎症因子的表达情况，旨在探讨CD4+记忆T细胞亚群在LTBI和活动性PTB诊断和疗效评估中的价值，为结核病发病机制的了解、治疗效果的评估及预防措施的研发提供一定参考依据。现汇报如下。

1、对象和方法

1.1研究对象

选择2020年9月—2023年9月在我院诊断为初治活动性肺结核患者(PTB组)40例，男24例，女16例，平均年龄(39.84±19.37)岁；结核潜伏感染患者(LTBI组)25例，男14例，女11例，平均年龄(37.32±18.66)岁。PTB、LTBI患者的诊断标准参考《中华人民共和国卫生行业标准—肺结核诊断(WS 288—2017)》。初治PTB患者治疗方案按照《肺结核诊断和治疗指南》进行2个月强化和4个月巩固抗结核治疗，定期随访半年。排除标准：(1)恶性肿瘤疾病患者；(2)慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、硅肺、尘肺患者；(3)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒感染者；(4)近3个月有糖皮质激素、免疫抑制剂应用史。另外选择于我院健康管理中心体检者25例作为对照组，其中男14例，女11例，年龄(42.31±21.82)岁，均经常规体检，血常规、胸部CT及结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)等检查排除MTB感染及呼吸系统疾病。所有研究对象均自愿参与本研究，签署相关知情同意书。三组间患者年龄、性别对比差异无统计学意义(均P>0.05)。

1.2流式细胞术测定记忆T细胞亚群

1.2.1血清标本的采集和处理：

使用EDTA-K2抗凝管抽取所有研究对象外周静脉血5mL,轻摇混匀，2 000r/min离心10min,取上清摇匀，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2外周血单个核细胞(PBMCs)的分离：

血细胞用2倍体积的PBS缓冲液重悬，缓缓加入预先含有淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)的离心管中，放置离心管设置2 000r/min离心30min,离心后小心吸取淋巴细胞层获取PBMCs。

将PBMCs用PBS重悬，分别加入FITC标记的抗人CD4流式抗体，PE-Cy7标记的抗人CD45RO流式抗体以及PE标记的抗人CD197 (CCR7)流式抗体(流式抗体均购自美国BioLegend公司),设相应的同型对照和阴性对照，混匀后4℃避光放置反应30min,再用PBS洗涤去掉多余流式抗体，PBS重悬后上流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)检测，所得流式数据文件用Flowjo软件分析，在FSC-SSC点阵图上设定淋巴细胞区域，以淋巴细胞目标群在CD4和SSC点阵图上选定CD4+T淋巴细胞区，最后在CD45RO和CD197点阵图上做4分法划区， 最后分别计算CD4+Tn(CD4+CD45RO-CD197+), CD4+Tcm(CD4+CD45RO+CD197+), CD4+Tem(CD4+CD45RO+CD197-)在CD4+T细胞中所占的百分率。

1.3血清炎症因子IL-17、IFN-γ浓度的测定

所有研究对象经空腹8h以上抽静脉血3～5mL,取上清摇匀，置于-80℃冰箱保存备检。采用双抗体夹心酶联免疫吸附方法(ELISA)集中同步检测所有研究对象血清炎症因子的水平，操作严格遵循试剂盒的说明书进行，用酶标仪于450nm处读取吸光度值，计算IL-17、IFN-γ各自的浓度值。

1.4统计学方法

采用SPSS23.0软件进行数据统计分析，定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析(q检验)。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1三组CD4+T细胞亚群表达水平比较

CD4+Tn:对照组CD4+Tn表达水平明显高于PTB组和LTBI组(P均<0.05),PTB组和LTBI组间的CD4+Tn表达水平无统计学差异(P>0.05)。CD4+Tcm: PTB组和LTBI组表达水平均显著增高(均P<0.05),特别是LTBI患者CD4+Tcm占到(12.66±4.40)%。CD4+Tem: PTB组CD4+Tem表达水平明显增高达(36.19±10.66)%,而LTBI组和对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1三组CD4+T细胞亚群表达水平比较

2.2三组炎症因子表达水平比较

PTB组患者血浆IL-17和IFN-γ的浓度要明显高于LTBI组和对照组(均P<0.05);LTBI组的IFN-γ表达水平高于对照组(P<0.05),但两组间的IL-17表达水平却无统计学差异(P>0.05),见表2。

表2三组炎症因子表达水平比较

2.3活动性肺结核患者治疗前后外周血记忆T细胞和炎症因子表达水平比较

PTB组患者在接受6个月有效抗结核治疗后共收集到17例患者完整血浆样本。经配对t检验分析，治疗后PTB患者CD4+Tem比例明显下降，CD4+Tcm比例增高，炎症因子IL-17、IFN-γ表达水平均低于治疗前(均P<0.05),见表3及图1。

表3活动性肺结核患者治疗前后外周血记忆T细胞 和炎症因子表达水平比较

图1 1例活动性肺结核患者治疗前后外周血CD4+记忆T细胞流式图变化

Q1区、Q2区、Q3区分别为治疗前的CD4+Tn、CD4+Tcm、CD4+Tem; Q5区、Q6区、Q7区分别为治疗后CD4+Tn、CD4+Tcm、CD4+Tem。

3、讨论

T淋巴细胞是人类最重要的免疫效应细胞，结核病的保护性免疫主要是由CD4+T淋巴细胞介导[2-3]。国内学者研究[4]发现PTB、肺癌和非结核性肺炎三组患者的外周血表达的CD45RO+记忆T细胞均较健康对照组升高，尤其以PTB组水平最高，提示疾病进展过程中诱导产生了大量记忆T细胞，且MTB更易刺激体内T细胞分化形成记忆T细胞。在小鼠结核模型中确定了这种保护介质是记忆CD4+T细胞而不是记忆CD8+T细胞[5]。本研究对照组CD4+T细胞亚群主要为Tn,占比高达(44.65±8.23)%,其CD4+Tcm的占比均低于PTB组和LTBI组，CD4+Tem的占比低于PTB组(均P<0.05)。CD4+记忆T细胞是机体预防细胞内病原菌如MTB再次感染的基础。与Tn相比，CD4+记忆T细胞激活时需要抗原的浓度更低，当再次遇到相同抗原时可在短时间内起到强有力免疫唤醒，能提供更及时精准免疫保护功能[6]。进一步对比发现PTB组和LTBI组CD4+Tcm表达水平均明显高于对照组(均P<0.05),且LTBI组升高更为明显。CD4+Tcm比例的提高说明Tcm在MTB感染人群中显著表达，虽然这种记忆T细胞几乎没有效应功能，但能稳定增殖并在抗原刺激下分化为效应型T细胞或Tem进一步发挥抗结核作用。因而高水平的Tcm细胞可以提高机体的细胞免疫应答的储备能力，在防止再感染方面发挥重要作用。活动性PTB患者的CD4+Tem不仅高于对照组也高于LTBI组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。Tem也称为“活化的记忆T细胞”,具有直接细胞毒活性，主要介导反应性记忆，在受到同一抗原的再次刺激时，能迅速产生大量如IFN-γ、IL-4等效应炎症因子，产生更快、更强和更有效的二次免疫应答[7]。本流式细胞检测分析的结果显示LTBI组Tcm细胞占比高达(12.66±4.40)%,而PTB组与之相比Tcm百分比下降，Tem型比例增加，主要原因：(1)记忆T细胞由中心型转变为效应型：Tcm也称为“静息记忆T细胞”,虽能在体内长期存在，但不直接发挥效应作用，活动性结核病时抗原的再次入侵可诱导大量记忆T细胞由Tcm型转化为Tem, Tem再迁移至外周炎症组织发挥速发性抗结核免疫杀伤[8]。(2)慢性感染导致的记忆T细胞耗竭：记忆T细胞以氧化磷酸化为主供能，LTBI患者体内持续的慢性MTB刺激，可使包括记忆T细胞在内的T细胞发生代谢重编程，向短寿命的末端细胞分化，最终导致Tcm等T细胞耗竭，Tcm数量下降是免疫功能低下的一种表现，不能将MTB局限杀灭，对已受MTB感染的靶细胞失去免疫监控作用，最终导致结核潜伏感染状态向活动性病变的转变[3,9]。

MTB感染机体后首先被巨噬—单核细胞聚集进行吞噬，同时激活T淋巴细胞发生变态反应，释放多种炎症因子[10]。IFN-γ能促进巨噬细胞活化，杀伤细胞内的MTB,进而增强其抗菌活性，在控制MTB感染中起到了重要作用。本研究中IFN-γ在三组间差异均明显(均P<0.05),可能原因是IFN-γ主要由记忆T细胞分泌，且以CD4+Tem产生为主[11]。IL-17是新发的记忆T细胞、单核细胞等产生的一种起调控作用的前炎症因子，被认为参与了机体多种炎性疾病的发生。研究[6]表明IL-17作为联系T淋巴细胞与中性粒细胞的重要介质，通过刺激支气管上皮细胞和血管内皮细胞合成释放趋化因子配体(CXCL)、巨噬细胞炎性蛋白2、黏附因子等，参与炎症状态下中性粒细胞在气道的募集，在针对多种细菌和真菌病原体的免疫中发挥着关键作用，而且IL-17与CD4+、CD8+T细胞数量，肺实质的破坏，肺部炎症程度等密切相关。LTBI患者肺部等无结核病灶，活动性PTB患者不仅存在肺实质的结核破坏，还可能合并MTB之外的其他病原体感染，因此LTBI组和对照组间IL-17差异无统计学意义，但PTB组IL-17浓度明显升高至(18.70±8.80)ng/L,与其他两组差异明显(均P<0.05)。

虽然Tcm不存在于外周组织，但具有淋巴细胞样归巢特征及高增殖能力。因而当有效抗结核6个月，病原体被清除后可以观察到外周血的Tcm表达提高，Tem的占比下降。和既往报道类似[11-12],活动性PTB患者治疗前存在高水平炎症因子环境，随着诊疗活动的开展，体内的细菌含量逐渐减少，IL-17、IFN-γ等炎症因子浓度也相应下降(均P<0.05)。

LTBI人群中会有5%～10%在一生当中某个阶段发展为活动性结核病[13];活动性结核病的发生除与感染的菌量及毒力等因素有关外，还与机体免疫功能密切相关[2]。目前LTBI和活动性结核病发病机制及诊断还不清晰，皮内注射用卡介苗对成年人保护效果不佳，迫切地需要新技术来最大限度地排除诊断障碍，更有效地防治MTB感染[6]。Tem细胞只能提供短期保护，而Tcm能够持久地监测MTB动态，为宿主提供长期保护，故Tcm对防止感染MTB或LTBI再活化发挥着更关键作用[3,14]。Torrado等[15]通过树突状T淋巴细胞诱导体外Tcm增殖活化后再注入机体，发现Tcm每上升5%,LTBI患者最终转变为活动性结核病概率可下降5%以上，同时异烟肼等抗MTB的有效率上升3%以上。目前卡介苗接种主要诱导产生的是Tem,而不是具有更持久记忆的Tcm。如何诱导Tcm的增殖和维持功能是抗结核疫苗必备的条件，是可以直接降低发病率的一级预防手段[5]。一种有效的疫苗需要激活中性粒细胞并募集至感染部位才能发挥杀菌机制，IL-17可介导机体中趋化因子配体(CXCL)-1和CXCL-5的表达，从而招募中性粒细胞迁移至MTB感染部位，参与肉芽肿的形成，控制MTB的扩散和传播[3]。在MTB感染模型中加入外源性IL-17已被证明可以通过激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)1/MAPK3机制增强结核病患者单核细胞对MTB自噬能力，减少MTB在细胞间传播，这也是目前疫苗研制的热点[14]。

综上所述，CD4+记忆T细胞亚群和炎症因子表达程度与结核病的发生、进展关系密切。检测外周血CD4+Tcm、CD4+Tem、IL-17和IFN-γ的水平不仅可作为MTB感染人群初步筛查的实验指标，还有助于PTB患者疗效的评估，特别是CD4+Tcm和IFN-γ两者有望作为PTB、LTBI患者的临床鉴别或分组的依据，高水平的CD4+Tcm、IL-17可能具有防治MTB感染或者潜伏状态再活化功能。

参考文献:

[3]庞远建,吴长新,王利花,等.CD4+记忆T细胞抗结核分枝杆菌感染及功能异常机制的研究进展[J].中华传染病杂志,2021,39(12):770-774.

[4]吕秋琼,柳红梅,许文芳,等.肺部相关疾病外周血T淋巴细胞表面标志物表达分析[J].疾病监测,2020,35(3):251-255.

[7]罗雅煊.不同临床阶段慢性HBV感染患者外周血T细胞免疫状态的研究[D].重庆:重庆医科大学,2020.

[8]王心静,曹志红,张金花,等.活动性肺结核病人外周血CD4+/CD8+Tim-3+ T细胞群内记忆细胞分布特点[J].免疫学杂志,2012,28(7):604-606.

[10]刘会,高江彦,霍琳,等.外周血sIL-2R､CD4+/CD8+､TNF-α对初治活动性肺结核老年患者化疗疗效的评估价值[J].国际检验医学杂志,2024,45(6):738-743,750.

[11]温淑芳,魏荣荣,李浩然,等.CD4+和CD8+T细胞在结核病免疫应答中的作用[J].中国防痨杂志,2024,46(4):479-484.

基金资助:皖南医学院中青年科研项目(WK2021F20);

文章来源:全斌,王妮,张强.不同结核感染人群CD4+记忆T细胞亚群及炎症因子表达的差异[J].医学理论与实践,2025,38(01):38-41.