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研究副结核病的诊断及防控

2020-06-24 218 上传者：管理员

摘要：副结核病是世界范围流行的以危害反刍动物为主的动物疫病，严重威胁畜牧业发展和人类公共卫生安全，我国将其列为二类动物疫病。由于该病病原感染机体的免疫反应复杂，需要根据不同感染时期施以不同的诊断方法；目前对于该病没有理想的疫苗可用，现有疫苗对预防感染无效；需要根据不同目标采取不同防控策略，国际通用策略为“大缸奶质量保证措施”(BMPAQ)和“密集副结核程序”(IPP)。未来需要研究更加方便、高效、快捷的诊断方法，加快新型疫苗研发、减少疫苗副作用及检测干扰，进一步强化多部门联动及防控宣传。

关键词：
副结核病
流行现状
结核病
诊断
防控策略
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副结核病又称约翰氏病（JD），是一种慢性、传染性肉芽肿性肠炎，表现为患病动物持续腹泻、体重减轻、生产力下降，最终死亡，可对社会经济、动物福利和公共卫生产生重要影响。为此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。目前，本病广泛流行于世界各国，特别是一些牛羊养殖业较发达的国家。对48个国家进行副结核病调查，结果发现大约50%的国家超过20%的牛群和羊群患有副结核病[1]。近年来有研究[2]表明，副结核病的病原可能与人类疾病关系密切，在50%的以持续性腹泻为特征的克罗恩病患者血液中可分离出副结核病病原。为及时诊断并防控该病，本文主要从病原学、危害及流行现状、诊断、疫苗和防控措施等方面，对副结核病进行概述。

1、病原学

副结核病是由鸟分枝杆菌亚种副结核亚种（MAP）感染所引起的。MAP能够感染所有反刍动物（如牛、羊、美洲驼、鹿等），其中牛感染最为常见，通常在幼龄期（断奶前）感染，并且大部分3岁以上才表现临床症状。据报道[3]，杂食动物和食肉动物（如野兔、狐狸、鼬鼠、猪）以及非人类灵长类动物也可感染MAP。

MAP是一种特殊的细胞内病原体，只能在易感动物的宿主细胞内繁殖，但能够在宿主环境以外的恶劣条件下长期存活。受感染的牲畜可不定期通过排便、泌乳排放病原体，造成MAP的粪-口传播，这也被认为是主要的感染途径[4]。

2、危害及流行分布

副结核病造成经济损失的因素包括产奶量下降、屠宰价值降低、被动淘汰增加、产犊间隔延长、久配不育以及诊断与潜在的治疗费用。在美国受MAP感染的奶牛群中，每头奶牛每年的经济损失估计为21～79美元[5,6];1996年，美国因MAP感染导致奶牛产奶量减少，由此引起的经济损失为（2±1.6）亿美元[7]。在澳大利亚、加拿大、法国和英国奶牛群中，每头奶牛每年的经济损失估计分别为45～88澳元、49加元、234欧元和27英镑[8,9,10,11]。有关其他物种感染MAP的经济损失报道较少。副结核病对英国绵羊业造成的经济损失估计为每年40万～3200万英镑[12];MAP感染使意大利奶羊场的利润效率从84%下降到64%[13]。此外，MAP与人类克罗恩病之间的关系一直是争论的热点[14]。从副结核病牛与克罗恩病人肠道感染症状的相似性以及克罗恩病患者体内大多能分离到MAP来分析，副结核病具有潜在的人兽共患传染病风险，它对公共卫生的影响意义重大[15]。

副结核病呈世界性分布，美国、英国、加拿大、澳大利亚、爱尔兰等国家均有该病流行。在美国至少22%的牛场中，有超过10%的牛感染MAP[16]。在欧洲，牛感染MAP的患病率约为20%；在瑞士和西班牙，绵羊和山羊感染MAP的患病率均超过20%[17]；在新西兰，69%的农场至少有1头动物MAP检测呈阳性[18]。在英国，MAP的牧场感染率为59%～77%[19]。

我国1953年于内蒙古首次发现副结核病，随后在黑龙江省、吉林省、河北省等地均有该病暴发，几乎覆盖我国北方大部分地区[20]。2012—2014年对西藏部分地区的468份牦牛血清进行MAP抗体检测，结果发现总体阳性率为1.92%[21]。2015年MAP抗体检测结果显示，内蒙古、黑龙江省、湖北省、四川省、安徽省、江苏省规模化牧场中的牛MAP抗体阳性率分别为2.09%、3.90%、2.05%、5.23%、8.00%、1.22%[22]。2014—2015年采集的3600份牛血清样品MAP抗体检测显示，MAP抗体平均阳性率为2.29%，其中山西、西藏、新疆、河北、青海、重庆、湖北等省（市区）的MAP抗体阳性率分别为3.75%、3.5%、2.2%、2.0%、1.5%、0.75%、0.5%[23]。

3、诊断

由于病原的特殊性，MAP感染后机体的免疫反应较为复杂，需要结合不同感染阶段的特征以及动物群体的实际情况，灵活使用不同的检测方法进行持续追踪，以寻找适合不同时期的检测方法。

3.1亚临床期诊断

亚临床期诊断的主要目的是在感染动物表现临床症状前做到早期确诊。有效的诊断方法应能从外表健康的动物中区分出感染动物[24]，并揭示其是否及何时具有传染性[25]。虽然可以通过MAP特异性PCR来检测粪便排菌情况，从而确定动物是否感染MAP，却不能显示何时具有传染性。这种诊断方法在流行率低的动物群体中根除副结核病是有效的[26]。检测牛抗体反应的新型MAP分泌蛋白SF2抗原可用于MAP感染的早期或亚临床阶段[27]。IFN-γ释放试验可用于检测细胞免疫介导的早期MAP感染[28]，但副结核菌素抗原成分的复杂性会影响到检测的特异性，所以需要对其进行改进和标准化[29]。

3.2临床期诊断

临床期诊断主要针对体液免疫反应，如ELISA检测MAP抗体。犊牛、羔羊感染MAP后需要经较长的时间（1年以上）才能产生ELISA抗体，而在新生动物中，较早检测出的ELISA抗体可能是由于吸收了初乳中的母源抗体所导致的[30]。ELISA的滴度可以预测MAP排菌的概率，这在通过清除感染牛来减少传播进而控制牛群副结核病时较为实用。此种情况下，ELISA可以代替粪便培养（PFC）或粪便PCR(IFC）检测，但是缩短检测间隔时间很重要[31]。

3.3整群监测诊断

环境采样检测是一种用于确定群体MAP感染状况的快速诊断方法，然而这种采样方法仅在相对密集的家畜饲养作业（如奶牛饲养）中足够敏感[32]。在放牧饲养（如绵羊和牛群）、环境采样检测中就没有足够的敏感性[33]。PCR检测相较于混合环境样品的培养，不仅可减少处理时间和成本，而且检测不依赖于样本中的活菌量，所以会有更高的灵敏度，尤其在冬季或在肥料积累时间过长的地方采集的样品。

使用商品化ELISA或PCR检测大缸奶/混合奶样是方便价廉的奶牛副结核病整群筛查方法。为确定牛群的MAP感染状况，可以使用ELISA或者直接PCR检测大缸奶中的MAP特异性抗体或者MAP抗原。大缸奶检测在短期内的一致性较高，但长期可能会受到畜群规模和ELISA阳性个体MAP流行率的影响[34]。

4、疫苗

理想的MAP疫苗不仅能够预防感染，保持阴性群体无MAP，还能够保护高流行率群体中的年轻和易感动物。研发MAP疫苗的一个关键在于能够引发抗感染免疫保护反应。现有疫苗可部分降低感染性或粪便中MAP排菌量，延长感染动物的潜伏期，减缓MAP排菌量由低向高发展，或降低副结核病临床病例的累积发病率，但对预防MAP感染无效[35,36,37,38]。菌苗、亚单位疫苗和载体疫苗也已研发上市，但效果均不理想[39,40,41,42]。减毒活疫苗（LAV）的一个优点是，它们能够刺激细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。LAV在小鼠模型中产生了强大的保护作用[43]，但在山羊模型中的研究[44]表明，LAV未显示有保护作用；另有研究[45]表明，LAV可以显著减少粪便排菌量。LAV尚未在牛模型中进行试验。此外，单基因敲除株可能不是最佳的候选疫苗，因为它们的减毒程度不足以刺激机体产生保护性免疫反应进而消除疾病。

Gudair疫苗已广泛应用于澳大利亚绵羊群，并已成为控制副结核病的主要措施。使用这种灭活疫苗降低了澳大利亚绵羊群MAP感染和粪便排菌引起的流行率，并大大降低了死亡率[46,47]。但这种疫苗不能预防MAP感染，且不良反应也较大，单独应用不能根除MAP感染[36]。与绵羊相比，牛尚无有效的疫苗，而缺乏有效防止MAP感染的疫苗是牛副结核病控制计划进展缓慢的一个主要因素。在全球范围内，无论是活疫苗（Neoparasec）还是灭活疫苗，大多都是以矿物油佐剂配制的MAP菌株316F为基础的，其中只有Mycopar疫苗在美国获得许可，且仅用于5%的美国乳品经营牧场[48]。Mycopar疫苗受到当地兽医机构的严格控制，因为在标准牛结核病检测中接种疫苗的牛更容易出现结核病假阳性[49]。

5、防控措施

目前世界上对副结核病尚无有效的治疗措施。虽然链霉素、异烟肼、利福平等药物可以减轻或缓解与MAP感染相关的临床症状（主要是体重减轻和腹泻），并有助于延长动物的寿命，但对副结核病的治愈没有任何效果[50]。此外药物的长期使用不仅会让病原体对药物产生耐药性，更会增加药物在机体内的残留。疫苗的使用虽然可以减少副结核病临床症状的发生，但是仍然无法彻底防止病畜向外界排菌，并且在接种后无法通过检测来鉴别免疫动物和感染动物，而处于亚临床期的感染动物持续向外界排菌会带来更大的安全隐患[51]。副结核病的防控需要根据不同目标（减少患病率还是根除MAP），采取不同的防控策略，如扑杀携带MAP的动物，采用减少新生儿/幼畜感染的卫生措施以及接种疫苗等[1]。由于副结核病是一种慢性消耗性疾病，临床表现最早出现在1～2岁，一般出现在4岁以后，所以建议副结核病的防控周期至少为5年。

5.1清除MAP感染牛

尽早识别并清除MAP感染动物、减少粪便排菌污染环境，可以切断MAP感染其他易感动物尤其是新生动物的途径。扑杀已知MAP感染牛的后代也是清除MAP感染的一种措施，因为胎儿在子宫内感染MAP的概率很高[52]。自2006年起，国际通用2种副结核病控制程序，即大缸奶质量保证措施与密集副结核程序。IPP于1998年推出，目标是从受感染的牛群中根除副结核病，并在经认证的无副结核病牛群中进行低风险贸易[53]。但是，农场主对这一方案的参与率很低，因为该方案的费用相对较高。因此，2006年启动了一项新的更经济的BMQAP策略，旨在减少人类通过乳制品接触MAP。该策略要求降低运送到加工厂的牛奶中的MAP滴度低于103PFU/L[54]。

防控策略中对检测后牛群的状态进行了分类。“状态A”指MAP检测阴性群，“状态C”为MAP检测阳性群，“状态B”是“状态C”牛群在扑杀所有MAP阳性动物后的状态。包括荷兰在内的几个国家规定乳品加工厂收购的牛奶至少要来源于“状态B”牧场。当牧场处于“状态C”时，加工厂不允许收购其产出的牛奶。

5.1.1IPP

执行IPP策略的牧场要进行5个年度评估：第1年评估，采用血清ELISA和IFC检测所有≥2或3岁牛，第2～5年评估，均采用PFC或IFC检测所有≥2或3岁牛。在5个年度牧场评估测试中均为阴性的牧场可被定义为MAP阴性牧场，反之则为阳性场，需要重新进行5个年度牧场评估测试。因此，牧场最短可在5年获得无MAP阴性牧场认证。阴性场认证后，每2年对MAP阴性牛群所有≥2岁牛进行1次粪便混合样本PFC监测，阳性场则需对混合样本中每个样本每年重新逐一进行IFC检测[54]（图1）。

5.1.2BMQAP

BMQAP相对IPP而言，程序简单易行，所有的评估检测都可以只依靠ELISA来完成。执行BMQAP策略的牧场，在最初的评估和监测程序中，ELISA结果可通过PFC来验证。检测为阴性的牧场被暂定为无MAP感染牧场，进入到每2年1次的牛群ELISA监测程序[54]；为阳性的牧场，每年对所有≥3岁的牛，实行MAP阳性动物淘汰处理，一直到检测不到阳性动物为止（图1）。

图1IPP和BMQAP控制策略

5.2减少新生动物MAP感染

加强农场生物安全，特别是在饲养幼畜期间，防止畜群内MAP传播的主要干预策略是防止新生动物接触成年动物的粪便[55]。动物出生后应立即隔离，避免粪-口传播，改善产犊区的卫生和初乳/牛奶喂养的管理。

5.3避免引进MAP感染牛

保护MAP阴性畜群免受MAP感染及避免引入MAP感染动物。而购买亚临床感染的动物被认为是群体间传播的主要因素[56]。此外，避免引进MAP感染动物的精液也是预防MAP感染的必须举措。

6、结语

对于副结核病，OIE目前还没有推荐的检测方法。ELISA法和分子生物学法虽然具有较大的优势，但不能有效区分感染动物处于何种阶段。对于副结核病的预防，需加快新型疫苗的研发制备，减少疫苗副作用及检测干扰。针对薄弱环节加快技术创新，寻求更加方便、高效、快捷的检测方法尤为重要。

总体而言，副结核病的流行传播是困扰全世界的一个重大问题，其对公共卫生安全的威胁迫使很多MAP感染国都提出了本国的副结核病根除计划。我国副结核病防治任重道远，需要强化政府领导和各部门职责，强化与卫生部门信息交流，加强副结核病防控宣传教育，提高牧场工作者及普通民众对副结核病的认识和重视。

参考文献：

[20]彭永.副结核分枝杆菌分离及小鼠感染模型的建立[D].北京:中国兽医药品监察所,2018.

[21]汪小强,韩照清,刘鑫宇,等.西藏部分地区牦牛副结核病血清流行病学调查[J].中国奶牛,2015(14):63-65.

[22]崔金磊,赵永春,吴彤,等.2015年我国部分省(区)规模化牧场牛副结核病的流行病学调查[J].畜牧与饲料科学,2016,37(3):97-99.