结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病。根据世界卫生组织2023年全球结核病报告统计，2022年约有1 060万人罹患结核病，其中约有130万人因此而死亡[1]。结核病严重威胁着人类健康乃至生命，其致病菌MTB与固有免疫细胞的早期相互作用在很大程度上影响感染结局。因此，阐明MTB侵入机体后对固有免疫细胞的调控机制至关重要。MTB主要以气溶胶的形式通过呼吸道侵入机体肺部，激活抗结核感染中的第一道防线肺泡巨噬细胞，发挥吞噬作用[2]。众所周知，巨噬细胞通过其表面模式识别受体，识别MTB表面的病原相关分子模式，对MTB产生免疫应答，借助释放的各种细胞因子杀伤、清除MTB。另外，释放的趋化因子可募集免疫细胞到达感染部位，进一步加强机体对MTB的免疫清除[3]。

MTB Hsp60是由GroEL1基因编码的热休克蛋白，参与分枝菌酸的合成，在逃避机体免疫清除过程中发挥了重要作用[4,5]。相关文献报道，Hsp60能被巨噬细胞表面Toll样受体识别，进而释放IL-10或TNF-α等细胞因子[6]。而在机体对MTB的应答中，不仅涉及炎症因子的释放，也与病原菌抗原提呈、炎症细胞趋化至病原菌部位相关。本课题组前期采用不同浓度MTB Hsp60重组蛋白在不同时间点刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞，发现该重组蛋白可抑制巨噬细胞抗原提呈功能从而逃避巨噬细胞的免疫清除，导致MTB感染[7]。然而，MTB Hsp60对巨噬细胞趋化功能的影响尚未见报道。基于此，本实验进一步采用100 ng/mL MTB Hsp60重组蛋白刺激巨噬细胞(RAW264.7),检测其趋化因子的释放、趋化因子受体的表达及趋化功能，以探究其对巨噬细胞趋化功能的影响。

一、材料与方法

1 材料

1.1 细胞与重组蛋白

MTB Hsp60重组蛋白构建于爱必信(上海)生物科技有限公司；RAW264.7巨噬细胞(CL0190)购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 主要试剂

培养基高糖DMEM(#11965092)、胎牛血清(#10100147C)购于Gibco公司(美国);青霉素-链霉素溶液(#C0222)购于碧云天生物技术有限公司；结晶紫染色液(#G1063)购于北京索莱宝科技有限公司；PBS缓冲液(#G4202-500 ML)购于武汉赛维尔生物科技有限公司；RNAiso Plus(#9109)购于TAKARA生物技术有限公司；RT Master mix for qPCRII(gDNA digester plus)(#HY-K0511A)和SYBR Green qPCR Master mix(universal)(#HY-K0501A)购于MedChemExpress; ELISA试剂盒：CCL2(#70-EK287/2-96)、CCL5(#70-EK2129/2-96)购于杭州联科生物技术有限公司；CCL3(#E-EL-M0007c)、CCL4(#E-EL-M0008c)和CCL12(#E-EL-M3003)购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；流式抗体：抗CCR1(#FAB5986A,APC)、抗CCR2(#FAB5986A,PE)和抗CCR5(#FAB5986A,APC)购于R&D公司；蛋白抗体：CCR1抗体(#A18341,1∶1000)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；CCR2抗体(#AF6387,1∶2000)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(#A0208,1∶1000)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(#A0216,1∶1000)购于碧云天生物技术有限公司；GAPDH抗体(#T0004,1∶10000)、CCR5抗体(#AF6339,1∶2000)购于Affinity Biosciences。

2 方法

2.1 RAW264.7巨噬细胞培养

用含有10%的胎牛血清及1%双抗的高糖DMEM培养细胞，根据细胞状态和密度对其进行传代、铺板和处理。

2.2 Real-time qPCR

采用100ng/mL MTB Hsp60刺激巨噬细胞24 h后，提取细胞RNA检测各趋化因子mRNA水平的表达。将TRIzol法抽提出的RNA逆转录为cDNA,随后以cDNA为模板进行Real-time qPCR实验。Real-time qPCR实验数据用2-ΔΔCt法分析目的基因的表达水平，引物序列见表1。

2.3 ELISA检测培养上清中的细胞因子

收集细胞上清，按照ELISA说明书检测趋化因子的表达水平。

2.4 Western blot检测

巨噬细胞表面趋化因子受体的表达MTB Hsp60处理巨噬细胞后提取细胞蛋白并定量。通过电泳、转膜及封闭等步骤后，加入CCR1、CCR2或CCR5一抗，GAPDH作为内参抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔、鼠二抗室温孵育2 h, 最后加入发光液于Bio-Rad凝胶成像系统进行曝光，采用Image Pro Plus软件和Graph pad Prism进行图像分析。

表1 引物序列

2.5 流式细胞术检测

巨噬细胞表面趋化因子受体的表达在MTB Hsp60处理巨噬细胞后，收集细胞，分别用CCR1、CCR2、CCR5抗体标记未处理组和处理组40 min后用PBS洗涤，并上机检测。

2.6 Transwell实验检测

巨噬细胞趋化功能在MTB Hsp60处理巨噬细胞后，收集未处理组和MTB Hsp60(100 ng/mL)处理组细胞的培养上清置于transwell板的下室，收集未处理组和处理组细胞，以每孔1×104的细胞密度铺在transwell板的上室培养24 h, 结晶紫染色后观察巨噬细胞的趋化结果。

3 统计学分析

采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，实验所得数据以均数±标准差的形式表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对各组间的差异进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子mRNA水平的影响

为了检测MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子mRNA水平的影响，提取细胞RNA。如图1所示，在100 ng/mL MTB Hsp60刺激巨噬细胞24 h后，其趋化因子CCL2、CCL3、CCL4及CCL12的mRNA水平无明显变化，CCL5的mRNA水平显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子受体表达的影响

为了检测MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞表面趋化因子受体的影响，采用100 ng/mL MTB Hsp60重组蛋白刺激巨噬细胞24 h后，提取细胞蛋白质，检测细胞表面趋化因子受体的蛋白表达。Western blot结果显示(图2A),巨噬细胞表面主要的趋化因子受体CCR1、CCR2蛋白表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。而其表面CCR5的变化不明显。在MTB Hsp60刺激巨噬细胞24 h后，收集细胞做流式检测，流式检测结果显示经重组蛋白刺激后，CCR1+、CCR2+巨噬细胞数量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。而CCR5+细胞数量增加不明显(图2B),与Western blot结果趋势一致。

图1 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子mRNA水平的影响(*P<0.05)   

图2 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子受体表达的影响   

3 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化功能的影响

为了验证MTB Hsp60对巨噬细胞趋化功能的影响，我们进一步采用处理组与未处理组的上清和细胞做transwell实验。如图3所示，与未处理组相比，MTB Hsp60处理后，更多的巨噬细胞被募集到transwell的下室，提示MTB Hsp60可能诱导巨噬细胞中某些趋化因子的产生，进而增强其趋化能力。而经过MTB Hsp60重组蛋白处理后的巨噬细胞表面趋化因子受体也显著增加，有更明显的被募集趋势(P<0.05)。

图3 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化能力的影响(*P<0.05,**P<0.01)   

为了进一步探究是何种趋化因子增强了巨噬细胞的趋化能力，我们检测了上清液中趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5及CCL12的释放水平。然而，ELLSA结果均未见明显差异(图4)。

图4 MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化因子的释放的影响   

三、讨论

致病菌MTB通常从呼吸道侵入机体被肺泡巨噬细胞识别后产生免疫应答[8]。当体内MTB负荷过多、毒力增大，会导致巨噬细胞无法有效清除MTB。同时，MTB在被巨噬细胞吞噬时面临着氧化爆发、低氧、低PH和低营养的严峻形势，就会通过产生“热休克蛋白”来响应这些变化[9]。

MTB Hsp60是由GroEL1基因编码的热休克蛋白，在热休克、氧化应激反应、巨噬细胞感染时上调表达[10]。它既是调控MTB生物膜成熟参与分枝菌酸合成的毒力蛋白，也是调节MTB感染中细胞因子依赖性肉芽肿反应的重要因子[11]。而肉芽肿作为MTB感染的诊断标志，在形成过程中受到趋化因子和趋化因子受体的调控，且趋化因子可通过分泌IFN-γ的Th1细胞触发细胞介导的免疫应答减轻MTB感染。在前期实验的基础上，选择100 ng/mL MTB Hsp60重组蛋白刺激巨噬细胞24 h后，检测巨噬细胞趋化功能的变化。Transwell实验结果提示，Hsp60能促进巨噬细胞的趋化功能。

趋化因子是一大类能与G蛋白偶联受体结合的分泌蛋白，负责调节炎症反应和宿主防御。其由五十多种配体和受体组成，主要在免疫细胞上表达[12]。趋化因子受体及其配体形成的信号网络对其他免疫细胞“定位”病原菌感染部位至关重要，可调节细胞分裂、存活、迁移和侵袭[13]。CC趋化因子及其受体的表达水平可能与结核病的易感性相关，有助于判断结核病病情严重程度[14]。CC基序趋化因子受体1(CCR1)在巨噬细胞上高度表达[15],与白细胞迁移、病原体清除以及Ⅰ/Ⅱ型细胞因子平衡密切相关。MTB感染早期，巨噬细胞聚集气道表达CCR2;若此过程中缺乏CCR2,则巨噬细胞对MTB的易感性增加[16]。在我们的实验中，MTB Hsp60能增加巨噬细胞表面CCR1、CCR2的表达(图2),可影响单核细胞和T细胞向肺部的早期迁移，让MTB受到更多免疫细胞的“围攻”。其中CCR1是对MTB应答的恶化因子，可将应答转变为更剧烈的炎症反应，从而加重结核病症状。而CCR2促进Th1细胞进入感染小鼠的肺部[17],是必不可少的保护性因子。CCR2/CCR1的平衡可作为结核病严重程度的诊断因子和潜伏性结核病向活动性结核病转化的标志物[18]。相关研究报道，结核患者淋巴细胞中CCR2低表达导致肉芽肿形成延迟和缺陷，结核感染坏死性病变增加[19]。同样，Hsp60敲除菌株也会抑制小鼠体内肉芽肿的形成。这表明，Hsp60调控肉芽肿生成可能也与其诱导CCR2的表达相关。同时，CCR5及其配体也是MTB感染中将巨噬细胞、T细胞等募集到肺部的关键因素，其启动子多态性与结核病易感性相关[20,21,22]。临床研究中，结核病患者外周血中CCR5的升高，可导致血小板-单核细胞发生聚集，这是血小板进入肺部的载体，可能参与肉芽肿的形成[23]。但在我们的结果中，MTB Hsp60对CCR5的表达影响不明显。这表明，MTB Hsp60对机体炎症反应、炎性肉芽肿的调控与CCR5相关性不高，这可能是菌体中单一蛋白成分致病性不如完整菌株致病性高，也可能是致病菌对人与小鼠的宿主差异所致。

为了明确MTB Hsp60是否通过CCR1、CCR2和CCR5受体信号途径影响趋化作用，进一步检测了趋化因子受体相关配体CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL12 mRNA水平的变化。CCR1的主要配体是CCL3和CCL5[24]。CCR2的配体CCL2的多态性与肺结核相关，可保护宿主免受过度炎症和由此产生的组织损伤，也被证明是MTB感染的易感因素。同时，CCR2与CCL5和CCL12的激活可以诱导上皮、间皮和炎症细胞的趋化性，但CCR5配体CCL3、CCL4和CCL5的产生与MTB的毒力以及肉芽肿的形成没有明确相关性[25]。上述受体发挥功能都与CCL5密切相关，CCL5是这些受体发挥功能的“中心”蛋白。CCR1和CCL5相互作用可改变体内外炎症水平，且CCL5以依赖CCR1的方式上调表达IFN-γ等细胞因子，对宿主造成损害[26]。此外，CCL5可募集Th1型免疫细胞到炎症位点，也能在IFN-γ的帮助下，诱导NK细胞增殖和活化，形成CC趋化因子活化的杀伤细胞清除病原体，而低水平的CCL5使各种免疫细胞的功能障碍，导致MTB耐药性增加[27],也能使肉芽肿形成缓慢，表现为IFN-γ反应延迟和对MTB生长控制不佳[28]。本研究结果显示，CCL5的mRNA水平明显升高，但ELISA实验检测CCL5释放没有明显差异。CCL5基因表达与蛋白表达不一致，其作用机制有待进一步探索。这也提示，MTB Hsp60可能通过其他趋化因子途径发挥募集巨噬细胞的作用。

综上，本研究结果提示MTB Hsp60重组蛋白能上调巨噬细胞中趋化因子CCL5的mRNA表达水平，能增加巨噬细胞表面趋化因子受体CCR1和CCR2的表达，并且能增强巨噬细胞的趋化功能。这可为深入探索MTB Hsp60在结核感染中对巨噬细胞等免疫细胞的功能影响提供研究基础。但本研究仅在体外细胞水平初步探讨了MTB Hsp60重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞趋化功能的影响及可能机制，对在结核感染中MTB Hsp60影响巨噬细胞趋化功能的深入调控机制，尚需进一步研究。

参考文献:

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[10]何磊,张鹭,彭超,等.结核分枝杆菌热休克蛋白GroEL1的研究进展[J].微生物与感染,2010,5(3):186-191.

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[22]何会姣,田爽,宁雪萍,等.鸟分枝杆菌MAV-2921基因编码蛋白的生物信息学分析及其对巨噬细胞凋亡的影响[J].中国病原生物学杂志,2022,17(1):75-80.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.81860291);2023年贵州省教学内容和课程体系改革项目(No.SJJG2023185);

文章来源:卫麟娜,高雪涵,董品志等.MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化功能的影响[J].中国病原生物学杂志,2024,19(02):157-161+171.