随着人们生活方式和节奏的改变，焦虑的人群越来越多。全世界约有10亿人患有精神疾病[1]。焦虑是一种心理、生理症状并存的疾病，是生活中最常见的心理疾病，不仅影响患者生活质量，同时还给患者家庭造成巨大的经济负担[2]。氟哌噻吨美利曲辛片是一种由氟哌噻吨和盐酸美利曲辛组合的一种复方制剂，主要用于治疗抑郁症和焦虑症[3-4]。精神、心理因素和肠道微生态紊乱是引起肠道应激相关疾病的重要因素[5]。肠道微生物在焦虑的发病过程中起着重要作用，其可能通过启动炎性反应介导肠道稳态失衡，进而导致“菌-肠-脑”轴功能紊乱[6]。

临床中，部分患者总是感觉自己身体某一部位不舒服，自认为患了某种疾病，辗转各地医院就诊，但就诊结果显示身体健康。临床上，医生常常将这类患者诊断为“焦虑状态”,而氟哌噻吨美利曲辛片是治疗焦虑的主要药物之一，其临床用量也比较大。基于此，研究提出一个假设，氟哌噻吨美利曲辛片除了能缓解患者焦虑症状之外，能否改变患者的肠道菌群，从而改善焦虑症状。通过查阅文献发现，氟哌噻吨美利曲辛片除了具有抗焦虑、抗抑郁的双重作用外，还能同时改善胃肠功能障碍、感觉异常，能有效改善腹部不适及精神伴随症状[6]。由此猜测氟哌噻吨美利曲辛片治疗焦虑的机制之一或许与调节肠道菌群有关。本研究探讨了服用氟哌噻吨美利曲辛片的焦虑患者肠道菌群的变化情况。

1、资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料

选取2022年1月至2023年6月浙江省人民医院毕节医院就诊的焦虑患者6例为研究组，另选取6例健康成年人作为对照组。诊断标准：参考美国《精神障碍诊断和统计手册(第5版)》中对于广泛性焦虑的诊断标准，焦虑障碍需满足以下标准：(1)至少6个月内，诸多时间或活动表现出过分的焦虑和担心(焦虑性期待);(2)个体难以控制的担心；(3)焦虑和担心包含下列5种症状中的至少2种：坐立不安或感到激动、紧张；容易疲倦；注意力难以集中或头脑一片空白；易怒/易激惹；肌肉紧张；(4)焦虑担心或躯体的症状引起有临床意义的痛苦，或导致社交、职业或其他重要功能方面的损害；(5)不能用其他精神障碍更好地解释。纳入标准：(1)诊断明确，汉密尔顿焦虑量表(HAMA)评分大于或等于14分，或医院焦虑抑郁情绪测量表(HAD)评分大于或等于11分；(2)入组时年龄18～65周岁；(3)体重指数(BMI)18.5～23.9;(4)理解本研究的性质，并签署知情同意书。排除标准：(1)精神发育迟缓，器质性精神障碍，头部创伤史，药物、毒品、酒精等滥用史；(2)曾罹患免疫相关疾病、严重躯体疾病及神经系统疾病(包括肿瘤、脑梗死、癫痫、脑出血等)、心脏疾病、血液系统相关疾病；(3)入组前1个月内服用过抗生素、微生态制剂及益生菌类药物；(4)入组前1个月内饮食结构、生活习惯出现重大改变；(5)妊娠或哺乳期；(6)近期腹泻、便秘；(7)不愿参加本研究。研究组中男2例，女4例；年龄(50.17±12.48)岁；无吸烟、饮酒史；合并慢性胃炎6例，合并高脂血症5例。对照组中男1例，女5例；年龄(39.83±13.06)岁；无吸烟、饮酒史；无慢性胃炎、高脂血症。本研究获得浙江省人民医院毕节医院医学伦理委员会审查批准[批准号：伦审(2021)10-1号]。

1.1.2 主要试剂与仪器

氟哌噻吨美利曲辛片购自丹麦H.Lundbeck A/S公司(批号：2725451),DNA抽提试剂盒(FastDNA®Spin Kit for Soil)购自美国MP Biomedicals公司，琼脂糖(西班牙Biowest Agarose),FastPfu Polymerase购自北京全式金生物技术股份有限公司，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自美国Axygen公司，NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit购自美国Bioo Scientific公司。离心机购自德国Eppendorf公司，超微量分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司，电泳仪购自北京市六一仪器厂，聚合酶链式反应(PCR)仪购自美国ABI公司，测序仪购自美国Illumina公司，酶标仪购自美国Biotek公司，微型荧光计购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 粪便采集及Alpha多样性分析

研究组给予氟哌噻吨美利曲辛片10 mg, 每天2次，疗程为4周。首次给予氟哌噻吨美利曲辛片前，收集研究组粪便标本1次，编号为CK1～6(CK组);末次给药后12～24 h, 再次收集研究组粪便标本1次，编号为FPMLT1～6(FPMLT组)。对照组给予常规宣教，在第4周收集粪便标本1次，编号为CON1～6(CON组)。粪便标本置于液氮罐液氮保存，待检。

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内物种的多样性。Alpha多样性指数包括Sob、Ace、Chao、Shannon、Simpson指数，可采用Shannon和Simpson指数来评估群落中操作分类单元(OTU)多样性高低。其中，Shannon指数越大，表明生物多样性越高；而Simpson指数越大，表示多样性越低。Coverage是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样品中序列被测出的概率越高，该指数反映测序结果是否代表了样品中微生物的真实情况。

1.2.2 肠道菌群分析

1.2.2.1 总DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书进行肠道菌群DNA的提取，得到总DNA。采用NanoDrop2000进行DNA纯度和浓度检测，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，设定电压为5 V/cm, 时间为20 min。

1.2.2.2 PCR扩增及Illumina测序

采用引物(上游引物为ACTCCTACGGGAGGCAGCAG,下游引物为GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增细菌16SrRNA的V3～V4区片段。PCR扩增体系：5×FastPfu Buffer 4 μL,2.5 mM dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL,下游引物(5 μmol/L) 0.8 μL,FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL,BSA 0.2 μL,基因组DNA 10 ng, 补双蒸水至20 μL。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 3 min, 变性95 ℃ 30 s, 退火55 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 45 s, 循环数为27,稳定延伸72 ℃10 min, 10 ℃保存直至反应结束。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，参照电泳初步定量结果，采用QuantusTMFluorometer对PCR产物进行定量检测。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit进行建库，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.2.2.3 生物信息学分析

为进一步识别焦虑患者给药前后的粪便微生物群落变化，绘制总丰度前50的物种群落的热谱图(Heatmap),并进行韦恩图(Venn)分析、主坐标分析(PCoA)、非度量多维尺度分析(NMDS)、线性判别效应量分析(LEfSe),与效应大小测量相结合，确定了丰度上具有显著差异的特征分类群。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism5.0统计软件进行数据处理。计量资料以

表示，组间比较采用单因素方差，进一步两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料以率或百分比表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 研究组治疗前后HAMD、HAD评分比较

治疗前，研究组HAMD、HAD评分分别为(37.33±2.94)、(28.83±2.79)分，表现出明显的焦虑情绪。采用氟哌噻吨美利曲辛治疗4周后，研究组HAMD、HAD评分分别为(12.83±2.93)、(12.00±2.61)分，与治疗前比较，差异有统计学意义(P<0.05)。HAMD评分从“有明显抑郁或焦虑”转为“可能有抑郁或焦虑”,但还未到达正常分值范围；HAD评分为“可能有明显抑郁或焦虑”,但评分较前明显下降。

2.2 对焦虑患者肠道菌群丰度及Alpha多样性的影响

应用IIIumina Miseq测序平台，完成18个样本的多样性数据分析，获得优化序列数目为1 333 788bp,优化序列碱基数目557 742 075bp,平均序列长度418bp。物种注释分析显示：13个菌门，21个菌纲、58个菌目、112个菌科、305个菌属、624个菌种及1 553个OTU。CON组Sob、Ace、Chao、Shannon指数显著高于CK组，CK组Simpson指数显著高于CON组，差异有统计学意义(P<0.05)。CK组Coverage指数与CON组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 对焦虑患者肠道菌群物种组成的影响

2.3.1 Venn分析

CON组、CK组、FPMLT组共有细菌物种OTU的数量为217。CON组肠道细菌物种OTU的数量为875,CK组OTU的数量为95,FPMLT组OTU的数量为81。CON组与CK组共有细菌物种OTU的数量为38,FPMLT组与CON组共有细菌物种OTU的数量为142。见图2A。

2.3.2 PCoA、NMDS分析

从一维和多维角度可以看到，CON组、CK组明显分开。FPMLT组与CK组有细微的差别，具有改善迹象。见图2B、C。

2.3.3 物种组成分析

为了探讨哌噻吨美利曲辛片对焦虑患者肠道菌群具体影响，进一步分析了不同分类水平上相对丰度排名前10位的细菌群落的组成特征，见图3。在不同分类学水平上，研究组与对照组肠道菌群组成明显不同，经氟哌噻吨美利曲辛片干预后，研究组肠道菌群结构有所改变。在门水平上，CK组以低丰度的Bacteroidota为主要特征，明显区别于CON组，差异有统计学意义(P<0.05)。在纲水平上，与CON组相比，CK组Bacilli丰度明显偏高，Clostridia和Bacteroidia丰度明显较低；FPMLT组Bacilli丰度降低，Clostridia丰度增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。在目水平上，与CON组相比，CK组Bacteroidales、Oscillospirales丰度明显降低，Lactobacillales丰度偏高，差异均有统计学意义(P<0.05)。在科水平上，与CON组相比，CK组Lachnospiraceae、Prevotellaceae和Ruminococcaceae丰度均降低，Enterococcaceae丰度升高；FPMLT组Lachnospiraceae丰度呈升高趋势，差异均有统计学意义(P<0.05)。在属水平上，与CON组相比，CK组Prevotella、Blautia和Faecalibacterium丰度均降低，Enterococcus丰度升高；FPMLT组Blautia丰度明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。在种水平上，与CON组相比，CK组s_metagenome_g_Prevotella、s_Faecalibacterium_prausnitzii、s_unclassified_g_Blautia丰度均降低，s_Enterococcus_faecium_g_Enterococcus丰度升高；FPMLT组s_unclassified_g_Blautia丰度显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。服用氟哌噻吨美利曲辛片4周后，研究组肠道菌群有所变化，主要表现在纲水平上的低Bacilli,科水平上的高Lachnospiraceae,属水平上的高Blautia,种水平上的高s_unclassified_g_Blautia,这4个菌群可能是治疗焦虑的关键菌群。见图5。

图1对焦虑患者肠道微生物多样性指数的影响

图2Venn、PCoA、NMDS分析

图3不同分类水平上相对丰度排名前10位的细菌群落的组成特征

图4各组差异物种分析

图5肠道菌群在不同分类学水平上物种分析(“+”表示正向调节作用)

2.3.4 群落Heatmap图

由Heatmap图可知相关性的大小范围为0.60～0.70,CK组与CON组具有差异性，FPMLT组和CON组呈较相似性。见图6A。

2.3.5 物种差异分析

进化分支图显示，各组间粪便的微生物群落在各个分类学水平上均有比较大差异。LEfSe分析显示，CK组有15个生物标志物的分类，FPMLT组有23个生物标志物的分类，其中CK组以Bacilli和Enterococcaceae为特征物种，CON组以Clostridia和Bacteroidota为特征物种，FPMLT组以Lactobacillaceae、Streptococcaceae和Blautia为特征物种。见图6B。

图6多级物种差异判别分析

3、讨论

肠道菌群与焦虑之间有着十分密切的关系[7]。本研究结果显示，焦虑患者肠道菌群的生物多样性明显低于健康人群，在门水平上，Bacteroidia丰度在健康人群的菌群中占有绝对优势，与以往研究报道相符[8]。在纲水平上，焦虑患者肠道菌群中主要以高Bacilli和低Clostridia、Bacteroidia为主要特征，3个菌纲明显区别于健康人群。Clostridia、Bacteroidia可能是导致焦虑的主要菌纲，以高丰度为有害。采用氟哌噻吨美利曲辛片治疗后，焦虑患者Bacilli丰度降低，这可能为焦虑患者带来一定益处。在目水平上，焦虑患者肠道菌群中Bacteroidales和Oscillospirales丰度明显降低，Lactobacillales丰度明显升高，3个菌目明显区别于健康人群，采用氟哌噻吨美利曲辛片治疗后，3个菌目丰度未有明显改善。3个菌目可能是导致焦虑的关键菌群，而不是治疗焦虑的关键菌群。高水平的Lactobacillales和低水平Bacteroidales、Oscillospirales,对健康人群来说可能不是有益的。提示采用氟哌噻吨美利曲辛片治疗后能在一定程度上增加焦虑患者肠道内微生物物种丰度及多样性。焦虑人群的肠道菌群在门、纲、目、科、属、种水平上区别于健康人群，这些菌群的改变有可能是造成焦虑的关键原因。

在科水平上，焦虑患者肠道中Lachnospiraceae水平被抑制，氟哌噻吨美利曲辛片可以改善这种抑制，高水平的Lachnospiraceae可能为焦虑患者带来益处。Lachnospiraceae属于梭菌目，是潜在的有益分类群和短链脂肪酸的生产者，其代谢产物丁酸盐和其他短链脂肪酸被认为是肠道-大脑微生物群的关键介质轴，可以影响神经活动和肠-脑信号的特性，如免疫和内分泌系统[9]。在属水平和种水平上，高水平的Blautia和s_unclassified_g_Blautia可能为焦虑患者带来益处，二者可能是治疗焦虑的关键靶点，可以通过药物增加肠道中Blautia和s_unclassified_g_Blautia的丰度来改善患者焦虑状态。Blautia是一类具有益生菌特性的厌氧菌，是肠道菌群中的优势属，与宿主生理功能障碍有显著相关性。Blautia在自闭、抑郁等精神疾病患者中已被确定为潜在的研究靶点[10]。此外，Blautia在肥胖、糖尿病、克罗恩病患者中以低丰度为特征，在炎症性肠病患者中以高丰度为特征[11]。本研究结果显示，焦虑患者肠道中s_Faecalibacterium_prausnitzii数量是减少的，其数量的变化可能是肠道菌群失调的迹象。Faecalibacterium prausnitzii是人类肠道菌群中最重要的细菌之一，在健康人群的粪便样本中大量存在，占细菌总数的5%以上[12],具有调节免疫的作用。在克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎症性肠病等各种肠道疾病[13-14],以及阿尔兹海默病的患者中，这种微生物的数量会减少[15]。此外，查阅文献发现，患有自闭症的儿童的Prevotella丰度较低，而且较多2岁儿童的行为问题与婴儿时期Prevotella水平的下降有关；在婴儿期后期，肠道中Prevotella丰度的增加可能预示着焦虑风险的降低[16-17]。这与本研究结果中焦虑患者肠道微生物群中Prevotella丰度降低相吻合。

综上所述，焦虑人群与健康人群肠道菌群之间存在一定差异，氟哌噻吨美利曲辛片治疗焦虑的同时可引起肠道菌群变化。在属水平上，Blautia可能是潜在的关键物种；在种水平上，s_unclassified_g_Blautia可能是潜在的关键物种。本研究进一步证明了肠道菌群的改变与焦虑患者疾病状态存在一定关系，同时也证实氟哌噻吨美利曲辛片的益处，而且各个水平靶点的初步发现可为后续深入的机制研究奠定基础。后续可在此基础上增加样本量进行靶点验证和更深入的探讨。

参考文献:

[4]肖院召,韩冠先.柴胡龙骨牡蛎汤联合氟哌噻吨美利曲辛片治疗焦虑抑郁患者的临床效果[J].河南医学研究,2020,29(7):1286-1288.

[5]何长富,汤泽敏,吴惠勤.双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合氟哌噻吨美利曲辛治疗腹泻型肠易激综合征的疗效观察[J].北方药学,2023,20(3):22-24.

[8]胡科,张同同,王国强.首发抑郁症患者肠道菌群特征及其与健康人群肠道菌群结构的差异[J].中国微生态学杂志,2022,34(12):1417-1422.

基金资助:贵州省卫生健康委员会科学技术基金项目(gzwkj2022-235); 贵州省毕节市科学技术局联合基金项目(毕科联合字sy[2022]3号);

文章来源:张旭,姚艳,杨正益,等.氟哌噻吨美利曲辛片对焦虑患者肠道菌群影响研究[J].现代医药卫生,2024,40(21):3608-3614+3624.