急性心肌梗死是临床常见的急危重症，目前经皮冠状动脉介入术和药物治疗等临床治疗手段虽然降低了其死亡率，但无法完全阻止心肌梗死后心室重塑的发生发展。心肌纤维化在心室重构中起着非常重要的作用，逆转心室重构、抗心肌纤维化治疗已经成为众多心血管病治疗的靶标，也是目前心脏病学中最棘手的难点问题之一[1,2,3]。

心肌成纤维细胞是心肌间质细胞的主要组成部分，参与心脏发育、细胞信号传导、电生理功能等过程[4]。转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-beta1,TGF-β1)是一种多功能的细胞因子，是公认的主要促纤维化因子[5,6]，心肌成纤维细胞在TGF-β1等刺激因子作用下，发生上皮间质转化(epithelisamesenchymaltransition,EMT)触发调控上皮细胞功能发生改变为间叶细胞诱导增殖转分化为肌成纤维细胞[7]，上皮间质转化是纤维化发生的病理基础，心肌成纤维细胞具有较强的分泌胶原蛋白的能力，是心肌组织受损时常见的异常增殖的细胞，是心肌纤维化组织重构的重要表现[8,9]。

Hedgehog基因呈多毛团状，像畏缩成一团的刺猬而得名，由分泌蛋白配体(Hh)、跨膜蛋白受体(Ptch)、跨膜G蛋白偶联受体(Smo)和神经质瘤相关癌基因(Gli)组成，在哺乳动物中存在3种Hedgehog同源基因：SonicHedgehog(SHH)、IndianHedgehog(IHH)和DesertHedgehog(DHH)，以SHH应用最为广泛，SHh通路对细胞命运的决定是通过调节多种Gli基因表达的组合完成，包括Gli1、Gli2、Gli3，其中Gli1是Hedgehog的激活因子也是靶基因[10,11,12]。Hedgehog-Gli(Hh-Gli)信号转导通路是与人体生长、发育及疾病的发生发展有着密切关系的细胞通路，广泛参与全身多组织器官等的发育及疾病的损伤修复等过程，如多种肿瘤的发生发展以及神经系统的发育等[13,14,15]。

该研究拟揭示TGF-β1在心肌成纤维细胞增殖分化中的作用以及Hedgehog-Gli信号通路在心肌纤维化形成发展中的影响，通过体内及体外实验共同探讨Hedgehog-Gli信号通路参与心肌纤维化增殖分化中的作用。

1、材料和方法

1.1 设计

动物建模实验及体外细胞学实验。

1.2 时间及地点

实验于2016年7月至2017年7月在重庆医科大学动物实验中心IVC动物房完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

雄性健康小鼠C57BL/640只，生长良好，体质量(30±10)g，小鼠全部饲养在重庆医科大学实验动物中心IVC(IndividuallyVetilatedCages)动物房，实验所有的操作均在无菌超净操作台里面进行。选取出生1-3d的SD乳鼠，SPF级别，取材地点：重庆医科大学实验动物中心2楼垂直层流超净台，实验动物合格证标编号：CQMULA【2010】182。实验方案经内蒙古医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为：YKD2016085。

1.3.2 实验试剂及仪器

TGF-β1购于美国PeproTech公司；兔抗人Gli1多克隆抗体、兔抗波形蛋白一抗、荧光标记素羊抗兔二抗购于美国Abcam公司；胎牛血清、DMEM(高糖)培养液购于美国Glibo公司；Ⅱ型胶原酶、DEPC水购于美国SigmaAldrich公司；RNA提取及反转录试剂盒购于上海富衡生物公司；苏木精-伊红及Masson染色试剂盒购于上海碧云天公司；肌钙蛋白测试卡条购于上海医疗器械有限公司；Image-proplus图像分析软件系统(日本，OLYMPUS公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物体内实验

(1)分组干预方法：共40只C57BL/6小鼠，随机分为4组：对照组，心肌梗死组，心梗+GANT61组，心梗+Cyclopamine组，每组10只。后2组每日尾静脉给予10μmol/LGANT61(Hedgehog信号通路下游产物Gli1的抑制剂)或10μmol/LCyclopamine(Hedgehog信号通路下游产物Smo的抑制剂)，连续给药2周，之后与心肌梗死组一起进行前降支结扎心肌梗死造模。

(2)心肌梗死模型的制备：小鼠称体质量，10%水合氯醛按0.3mg/g的剂量腹腔麻醉，待挣扎不剧烈时，用固定胶带将小鼠固定，碘伏消毒胸颈部皮肤备皮，气管切开插管，调整好呼吸机参数辅助呼吸，小鼠取右侧卧位，横向逐层切开皮肤，剪开肌肉，左侧第三、四肋间钝性分离，充分暴露左心耳及左心室，吸取两三滴利多卡因注射液轻滴于心脏表面，体式显微镜下，用7-0带线缝合针结扎左冠状动脉前降支下1/3处，进针深度选取0.5mm为准，连接心电图机，观察心室前壁颜色变化，20min左右可见远离梗死区域心肌组织呈深红色，而结扎区域心肌变为苍白色，且结扎区域心肌室壁运动明显减弱，待有自主呼吸，脱机缝合并再次消毒。术后予肌注青霉素粉针10×104U/d，给药3d。

心肌梗死造模成功的标准：(1)术后心电图可见广泛导联ST段抬高；(2)造模成功6h以后检测肌钙蛋白(cTNT)显示为阳性，肌钙蛋白检测试剂盒阳性标准为：试剂盒指示标识变为深红色。符合以上2条即为心梗造模成功，见图1。

(3)心肌组织病理学检测：心肌梗死组造模成功后3,7,14d取材，同时取对照组小鼠的正常心肌，心肌组织石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红及Masson染色后光镜下观察心肌组织红染，胶原纤维蓝染，明显可见纤维化范围。计算机扫描，采用Image-proplus图像分析软件计算测定心肌胶原面肌，随机切片5个视野取平均值。

(4)实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Gli1mRNA表达：提取4组小鼠的新鲜心肌组织(心肌梗死组3,7,14d，对照组及2个抑制剂组梗死后14d取材)，Invitrogen-Trizol进行RNA提取，利用A260/A280比定量检测，每份RNA样本的定量检测采用OneStepRT-PCR试剂盒(TakKalabiological,Tokyo,Japan)，首先进行反转录(42℃，5min,5℃，10s)，然后利用ABIPRISM7900HT序列系统检测进行PCR反应(95℃反应5s,60℃反应30s,40个循环)，根据目的基因数量计算孔数，最少3个，外加预留1个。将RNA反转录为互补DNA，设计引物序列，β-actin为内参，通过2-ΔΔCt检测mRNA含量，引物链(PCR引物由上海生工有限公司设计合成)见表1。

表1|引物序列

(5)Westernblot法检测Gli1的蛋白表达：提取各组小鼠新鲜心肌组织(取材时间同RT-PCR)，利用NE-PER™细胞核和细胞浆提取试剂(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,USA)提取心肌组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，12%SDS-PAGE凝胶分离蛋白电泳转膜，2%BSA(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis,USA)溶于PBS,4℃冰箱中过夜，封膜，后将膜放置于已经稀释好的山羊抗兔二抗中(1︰1000)，室温下孵育2h,A、B液试剂按体积等量混合后配置显影剂，使其与膜蛋白要充分接触。采用增强化学免疫荧光仪检测，Gel-Pro分析软件检测每个目标泳道分光度，GAPDH相对光密度比值表示，最后进行胶片扫描及拍照。

(6)免疫荧光染色观察Gli1时空表达：取对照组及心肌梗死组14d小鼠离体心脏，预冷4℃的PBS冲洗5min×3，不同浓度蔗糖分别行梯度脱水(浓度分别为15%及30%)，优化切片温度OCT进行包埋制备5μm的切片，用0.1%Triton液破膜，37℃孵育1h,10%山羊血清一抗1︰50稀释，4℃孵育过夜，预留其中一管，予PBS作为阴性对照组使用，用PBS在室温下冲洗10min×3，二抗37℃环境下孵育45min，注意操作中要避光，PBS在室温下冲洗10min×3，最后用甘油封固，5min后镜检观察。

1.4.2 细胞实验

(1)心肌成纤维细胞培养及鉴定：颈椎脱臼法处死SD乳鼠，局部消毒，暴露获取心脏，PBS反复冲洗，剪碎组织，胰酶消化及差速贴壁法原代培养心肌成纤维细胞，培养于DMEM和EMEM培养基(GIBCO公司，Rockville,MD,USA)，倒置相差显微镜观察SD乳鼠心肌成纤维细胞形态及抗波形蛋白抗体免疫荧光鉴定。

(2)TGF-β1干预对心肌成纤维细胞Gli1mRNA及蛋白表达的影响：选取传代两三代的心肌成纤维细胞，用无血清培养基培养，将细胞接种于24孔板，每孔100μL(5×105细胞)，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育24h，完成同步化，然后选用4种不同质量浓度0,1,5,10μg/L的TGF-β1进行药物干预，每组细胞加药物都需要换液，空白组加DMSO，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育24h。通过RT-PCR、WesternBlot、免疫荧光检测Gli1mRNA及蛋白表达。

(3)TGF-β1干预对心肌成纤维细胞上皮间质转化的影响：将传代后的心肌成纤维细胞分为2组，对照组和TGF-β1干预组，将细胞接种于24孔板，每孔100μL(5×105细胞)，根据上一个实验确定的最适TGF-β1的质量浓度(10μg/L)进行诱导干预，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育24h，免疫荧光法检测肌成纤维细胞特异性标记物a-SMA表达。

(4)Hedgehog通路抑制剂对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞Gli1表达及上皮间质转化的影响：将传代后的心肌成纤维细胞接种于24孔板，每孔100μL(5×105细胞)，实验分为3组：对照组，GANT61组(10μmol/LGANT61)及Cylopamine组(10μmol/LCylopamine)，后2组先加相应抑制剂干预24h，之后3组均加入10μg/LTGF-β1，培养24h后行RT-PCR及荧光免疫检测，观察Gli1的mRNA表达变化，观察GANT61对TGF-β1刺激的成纤维细胞上皮间质转化标记物表达的影响。

1.5 主要观察指标

(1)建模成功后小鼠梗死心肌的病理变化及Gli1的mRNA、蛋白及荧光表达；(2)TGF-β1诱导心肌成纤维细胞，特异性阻断Hedgehog-Gli通路，定性定量检测Gli1及上皮间质转化标记物表达变化。

1.6 统计学分析

全部的实验重复3次以上，应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，结果采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析AVOVA法，如果方差出现不齐时，Welch法校正。以P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 动物实验结果

2.1.1 建模成功率

小鼠共计40只，建模成功25只，建模成功率为62.5%。分析小鼠主要死亡原因为：感染、肺损伤及麻醉复苏不成功等。

2.1.2 心肌梗死后心肌纤维化病理变化观察

小鼠经左冠状动脉前降支结扎术，术后可见结扎的损伤区域心肌收缩幅度明显减弱，颜色变苍白紫绀缺氧状态，待术后取标本时发现心肌梗死区域心肌组织被纤维瘢痕组织所代替。心肌病理学染色可见：心肌纤维红染，胶原纤维蓝染，心肌梗死发生后心肌细胞排列逐渐紊乱，炎症细胞浸润，心肌纤维断裂，纤维化形成，随着时间延长，纤维化逐渐加重。小鼠心梗组织切片经苏木精-伊红染色处理后，光学显微镜下观察切片。可见结扎区域梗死部位心肌坏死，少量心肌细胞存活，大量炎症细胞浸润，胶原纤维异常增生堆积，心肌纤维断裂，排列结构紊乱，见图2。

Masson染色观察组织切片，心肌组织中蓝色胶原增多明显，清晰可见纤维化修复病灶存在。坏死心肌溶解，纤维化形成。梗死病灶逐渐扩大。心肌组织红染，胶原纤维蓝染，明显可见纤维化范围，见图3。

2.1.3 小鼠心肌梗死后Gli1mRNA及蛋白表达

RT-PCR结果显示：心梗发生后Gli1mRNA表达水平随着时间延长，表达逐渐增多。WesternBlot结果显示心梗发生后随着时间延长Gli1蛋白的表达也是逐渐升高，结果同RT-PCR一致，呈时间依赖性表达增加，见图4。

2.1.4 小鼠心肌梗死后荧光免疫法显示Gli1时空表达

选取正常心肌组织及心肌梗死后2周的心肌组织进行荧光免疫法检测，结果显示心肌梗死发生后14d时Gli1含量时空表达显著，图5中红色荧光部分即为阳性表达。

2.1.5 Hedgehog通路抑制剂抑制小鼠心肌梗死后Gli1表达

已经证实心肌梗死后心肌组织中Gli1的mRNA及蛋白表达增高，加入Smo及Gli1的特异性阻断剂Cyclopamine和GANT61特异性阻断Hedgehog-Gli通路，行RT-PCR及免疫荧光检测，结果显示加入抑制剂后Gli1的mRNA及蛋白时空表达均下降，见图6。

2.2 细胞实验结果

2.2.1 SD乳鼠心肌成纤维细胞鉴定

差速贴壁培养法培养60-90min后，可见心肌成纤维细胞贴壁，倒置相差显微镜下观察新生SD乳鼠心肌成纤维细胞形态，多为不规则形，三角形或星形，一般含有两三个细胞核，核较大而且多居中，细胞核呈卵圆形，胞质透明(图7A)。随着细胞融合度的不断增加，逐渐变为梭形。波形蛋白Vimentin是存在于间质起源细胞中间丝的主要结构蛋白，是心肌成纤维细胞特异性生物学标记物，波形蛋白Vimentin呈阳性表达，证实培养的细胞为心肌成纤维细胞，图7B中绿色荧光部分即为阳性表达。

2.2.2 TGF-β1诱导心肌成纤维细胞Gli1呈高表达

心肌成纤维细胞在不同质量浓度的TGF-β1(0,1,5,10μg/L)刺激作用下，通过RT-PCR、WesternBlot、免疫荧光检测发现，TGF-β1刺激心肌成纤维细胞后Hedgehog信号通路的下游的因子Gli1的表达明显增加，证实了Gli1参与心肌纤维化发生发展的过程，且随着TGF-β1质量浓度增加，Gli1表达量逐渐增加，呈剂量依赖正相关，见图8,9。选择下面实验的最佳TGF-β1质量浓度为10μg/L。

2.2.3 TGF-β1诱导心肌成纤维细胞发生上皮间质转分化

TGF-β1干预心肌成纤维细胞24h后，免疫荧光法检测a-SMA，与对照组相比，细胞荧光强度明显增加。证明TGF-β1可以诱导心脏成纤维细胞发生上皮间质转化增殖分化为肌成纤维细胞，表现为肌成纤维细胞特异性标记物a-SMA表达，见图10。

2.2.4 Hedgehog通路抑制剂显著抑制TGF-β1诱导心肌成纤维细胞Gli1的表达

用Smo及Gli1的抑制剂Cyclopamine和GANT61特异性阻断Hedgehog-Gli通路，加入10μg/L的TGF-β1诱导细胞，行RT-PCR及荧光免疫检测，结果均显示，与对照组比较，加入抑制剂组的Gli1表达均有下降，见图11。

2.2.5 Hedgehog通路抑制剂显著抑制

TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞上皮间质转分化免疫荧光检测发现，与对照组相比，药物干预组上皮间质转化发生的生物标记物E-Cadherin表达增高，Vimentin表达降低，其中GANT61干预后Vimentin表达下降更为明显，说明GANT61的抗纤维化作用更强。证实GANT61可阻断TGF-β1诱导的上皮间质转化，可减轻心肌纤维化的发生发展，见图12。

图1|心电图(A)联合肌钙蛋白检测盒(B)判定造模成功

图2|各组小鼠心肌病理组织学变化(苏木精-伊红染色，×100)

图3|各组小鼠心肌病理组织学变化(Masson染色，×100)

图4|小鼠心肌梗死后Gli1mRNA(A)及蛋白(B)表达

图5|正常组(A)及心肌梗死后14d(B)Gli1蛋白荧光表达情况(×100)

3、讨论

冠心病作为严重威胁人类健康的心血管疾病，是引起心肌纤维化的主要病因之一[17]，心肌纤维化是多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理表现，心肌纤维化发生时心脏成纤维细胞被过度激活，增殖并向坏死区域迁移，转化为分泌能力更强的肌成纤维细胞，从而分泌过量胶原，修复坏死心肌组织，引起心脏结构重塑，目前临床研究的目的主要为抗重塑治疗。如果能在心肌纤维化早期发生的阶段即开始进行干预，可以显著提高患者的生活质量和生存率，明显缓解功能减退[18]。

图6|Hedgehog通路抑制剂对小鼠心梗组织中Gli1mRNA及时空表达影响

图7|倒置相差显微镜观察心肌成纤维细胞形态(A)及波形蛋白的免疫荧光(B)鉴定(×100)

图8|转化生长因子β1(TGF-β1)诱导心肌成纤维细胞中Gli1mRNA(A)和蛋白(B)的表达变化

TGF-β1调控诸如生长分化及组织修复等多种过程，可以参与心肌纤维化发生，诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。在心脏受到损伤时，TGF-β由炎症因子刺激释放，引起胶原蛋白等分泌增加，使心肌细胞外基质堆积增加，参与器官组织损伤修复[19]。上皮间质转分化是人体正常发育过程中或者机体在各种致病因素刺激下，上皮表型向间质表型转分化的过程，进而失去正常功能，组织器官发生纤维化异常增殖[20]。

图9|荧光免疫法检测转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞后Gli1的时空表达(×100)

图10|荧光免疫法检测转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞后a-SMA表达(×100)

Hedghog-Gli信号通路在胚胎发育、器官形成以及形态维持中扮演者重要的角色，性质高度保守，近年来越来越多的研究表明其异常活化广泛参与全身多组织器官疾病的损伤修复过程，其中在肿瘤的进展迁徙中研究较多，ZHANG等[21]在《OncolLett》上报道Hedghog信号通路参与胰腺癌细胞上皮间质转化迁徙分化。目前Hedghog信号通路在心肌纤维化中的相关作用尚不明确。

此次研究以心肌梗死小鼠为模型，研究小鼠心肌梗死后纤维化病理过程及纤维化形成的形态学改变过程。通过结扎小鼠的冠状动脉前降支来建立急性心肌梗死模型，这种方法最大的优点是符合临床心梗的病理发生过程，齐同性好。通过苏木精-伊红及Masson染色来观察心肌梗死后3,7,14d的组织病理改变，随着时间的延长，纤维化渐加重，实验中病理染色观察到心肌梗死14d时心肌纤维化条索形成广泛，炎症反应及纤维化发生明显。行RT-PCR及Westernblot实验证实随着心梗时间的延长，Gli1的mRNA和蛋白的表达逐渐增加，呈时间依赖性，同时荧光免疫定性测定证实了心肌梗死后Gli1时空表达，当特异性阻断Smo及Gli1信号通路后，荧光定量PCR及Westernblot检测Gli1的mRNA和蛋白表达均下降，纤维化缓解，从动物体内实验证实了Gli1参与心肌纤维化的发生。

图11|Hedgehog通路抑制剂对转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞中Gli1mRNA及时空表达影响

图12|Hedgehog通路抑制剂对转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞上皮间质转化的抑制作用(免疫荧光染色，×100)

此次研究选用出生1-3d的SD乳鼠，选用差速贴壁法及胰酶胶原酶消化传代等实验方法进行原代细胞心肌成纤维细胞分离培养及传代，从形态学观察和免疫荧光染色两方面进行心肌成纤维细胞的鉴定。心肌成纤维细胞经过TGF-β1诱导后，通过荧光定量PCR及Weaternblot检测Gli1的mRNA及蛋白表达，发现Hedgehog信号通路下游因子Gli1的表达与心肌纤维化形成呈浓度依赖性正相关表达。同时细胞免疫荧光也说明了同样的结果，而当加入了Smo及Gli1的特异性抑制剂Cyclopamine和GANT61后，荧光定量PCR法及免疫荧光法检测Gli1的mRNA和蛋白定位表达，均提示加入抑制剂后可有效抑制心肌成纤维细胞细胞中Gli1的表达，伴有上皮间质转化发生的生物标记物E-Cadherin表达增加及Vimentin表达减少，提示加入特异性抑制剂后纤维化缓解，其中GANT61抑制纤维化作用最明显，从体外细胞实验证实Gli1通过Hedgehog信号通路参与心肌纤维化发生。

参考文献：

[16]李小群,高凌志,张进,等.高效建立成年小鼠心肌梗死模型[J].四川动物,2012,31(4):635-638

聂慧娟,黄织春.转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J].中国组织工程研究,2021,25(05):754-760.

基金:内蒙古自然科学基金面上项目(2016MS(LH)0802),项目负责人:聂慧娟.