心肌梗死（myocardial infarction,MI）是中国居民致残和致死的主要心血管疾病之一[1]。尽管MI后患者的存活率显著增加，但是MI后患者的再住院率依旧很高，因此如何预防MI后并发症、改善患者生活质量显得尤为重要。心脏康复作为一种常用的治疗方法，可以帮助患者恢复健康，并通过运动等训练手段改善患者心功能，已被美国心脏病学会推荐为ⅠA级指南[2]。近年来，间歇性低氧（intermittent hypoxia,IH）在心血管疾病中得到了广泛研究，被证明有多种生物效应。本课题组前期研究发现IH干预可通过增加MI大鼠δ-阿片类受体表达[3]，调控MI大鼠AMP活化蛋白激酶（AMPK)α1/SIRT3通路[4]，改善线粒体结构，调节心肌脂肪酸代谢，从而对心脏产生保护作用。

IH在缺血-再灌注的心肌模型中具有调控细胞凋亡的作用[5,6]。心肌细胞损伤主要由心肌细胞的不可逆凋亡引起[7]。此外，细胞凋亡被认为是MI后心肌细胞丢失的主要来源，也是心室重塑和心力衰竭发展的重要因素[8,9]。Caspase依赖的细胞凋亡已被证明在缺血性心肌损伤中发挥重要作用[10]，通过观察caspase家族的活跃程度，可以深入地了解细胞凋亡情况。越来越多的证据表明，细胞凋亡会导致严重的左心室功能障碍[11,12]。Z-VAD是经典caspase抑制剂，Liao等[13]研究发现，Z-VAD下调了缺血-再灌注诱导的细胞凋亡，增加了心脏收缩功能的保护作用。因此，制定调节细胞凋亡的策略，对于预防MI后心功能障碍是必要的。

研究发现，丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK)1/2信号通路能调节心血管疾病的细胞凋亡过程[14]。在人结肠癌细胞中，抑制MEK/ERK通路可以缓解因轻度缺氧导致的细胞增殖过程[15]。此外，MEK/ERK通路可以减轻缺氧诱导的H9C2细胞损伤[16]。目前，MI后早期IH干预能否抑制MEK/ERK信号转导和MI后心肌细胞凋亡及其内在的机制尚不清楚。因此，本研究旨在通过体内、外研究，探讨IH对MI小鼠心肌组织的影响，进一步探讨细胞凋亡在IH影响心脏损伤中的作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6成年雄性小鼠24只，8周龄，体重18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，予（21±2）℃、（50±10）%的相对湿度下，12 h的光照和黑暗循环中饲养，自由取水。本实验由天津医科大学总医院实验动物伦理委员会批准（伦理批准号：TMUaMEC2018037）。

1.1.2 试剂

MEK抗体、p-MEK抗体、ERK抗体、p-ERK抗体和cleaved caspase 3抗体购自美国affinity公司；GAPDH抗体购自中国爱博泰克生物科技有限公司；Masson试剂盒购自中国北京索莱宝科技有限公司；Tunel试剂盒购自中国塞维尔生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清、链霉素购自美国Gibco公司；大鼠心肌细胞H9C2购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2 仪器

小动物麻醉机购自中国广东海利集团有限公司；化学发光凝胶成像仪购自中国上海天能科技有限公司；荧光显微镜购自日本OLYM-PUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及MI造模

24只雄性小鼠随机划分为4组，分别为假手术组（SHAM）、假手术低氧组（SHAM-IH）、心肌梗死组（MI）以及心肌梗死低氧组（MI-IH），每组6只。依据本课题组先前研究方案[17]，采用结扎左冠状动脉前降支构建心梗模型。异氟烷麻醉小鼠并固定，于第3、4肋间做一个斜切口，进行肌肉钝性分离后，充分暴露心脏，于左心耳下2 mm处结扎左冠状动脉前降支。SHAM组和SHAM-IH组仅接受胸腔开放手术，未对左冠状动脉前降支进行结扎。模型构建成功后，所有小鼠休息1周。

1.2.2 低氧训练及干预方式

SHAM-IH组和MI-IH组于造模1周后放于低压氧舱内，关闭舱门逐渐升高负压直至形成海拔5 000 m、13%氧浓度状态。4 h/d,5 d/周[4,18]，其余两组放于常氧环境下，干预时间4 h/d,5 d/周。

1.2.3 超声心动图

在干预前、干预4周后，分别对小鼠进行超声心动图检查，采用M型超声测量法测得左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、缩短分数（left ventricular shortening fraction,LVFS）。每次测量至少超过5个心动周期，每个周期至少拍摄3～5个图像来测量心功能参数。

1.2.4心肌纤维化检测

4周干预后，将小鼠注射戊巴比妥钠处死，将小鼠心脏组织完整取出，浸泡在4%多聚甲醛中，进行固定2 d左右，在梯度酒精（75%、80%、95%、100%）中分别脱水2 h，随后浸泡于二甲苯中使其透明化。用石蜡包埋组织，冷却。用自动切片机将包埋好的蜡块切片，每张厚度约为5μm。根据试剂说明，将石蜡切片脱水后，用Weigert铁苏木素染色溶液染色8 min、酸性乙醇分化液分化10 s、试剂C蓝化液反蓝4min、丽春红洋红溶液染色10min、磷钼酸溶液清洗1 min、苯胺蓝染色液染色1 min。冲洗后脱水、透明、封片、镜下观察拍照。

1.2.5 心肌组织Tunel检测

心脏石蜡包埋后，放入不同的乙醇浓度（100%、90%、80%、70%）中脱蜡。按照1 9的比例将PBS溶液稀释蛋白酶K，每个样品滴加100μL的蛋白酶K溶液。随后滴加试剂盒中的Equilibration Buffer溶液50μL到每个样本，室温下孵育15 min。加入56μL标记液，在37℃恒温箱中孵育1 h。洗涤样本后，滴加DAPI试剂20μL于样本，室温放置7 min。最后中性树脂封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.6 细胞培养及分组

大鼠心肌细胞H9C2在添加50μg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM中培养，37℃下在5%CO2的培养箱中培养。在六孔板上培养H9C2细胞，按照实验要求并将其分为3组，即Control组（Con组）、过氧化氢组（H2O2组）、过氧化氢+MEK抑制剂组（H2O2+U0126组）。Con组不做任何处理，H2O2组和H2O2+U0126组首先用200μmol H2O2处理心肌细胞，诱导氧化应激模型。后H2O2+U0126组中加入10μmol U0126干预16 h[19]。

1.2.7 蛋白印迹检测

用裂解液从组织和细胞中提取蛋白质，通过BCA测定蛋白浓度，根据分子量，用10%的浓缩胶和分离胶进行电泳，电泳90 min，转膜90 min,5%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h。添加稀释后的ERK1/2(1 1 000）、MEK(1 1 000）、pMEK(1 1 000）、p-ERK1/2(1 1 000）、cleaved caspase 3(1 1 000）、GAPDH(1 1 000）抗体4℃下孵育过夜，GAPDH作为内参。添加二抗（1 2 000)37℃孵育1 h，电化学发光液检查特定的蛋白条带，Image J软件测定灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 27.0和Graph Pad Prism 9.0软件对所有数据进行处理，符合正态分布的资料以±s表示，当数据满足正态分布和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析。方差不齐采用非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 IH对小鼠生存活动的影响

4周干预过程中4组小鼠均无死亡。但MI组小鼠活动较少，食欲较差，生长缓慢，MI-IH组小鼠活动逐渐恢复正常。

2.2各组小鼠心脏超声结果比较

超声心动结果显示，MI组和MI-IH组左心室前壁运动幅度降低呈平坦状，提示左心室出现梗死。干预前，与SHAM组相比，MI组和MI-IH组LVEF和LVFS均明显下降（均P<0.001);SHAM组和SHAM-IH组间比较无差异，MI组和MI-IH组间比较无差异（均P>0.05）。干预4周后，与MI组相比，MI-IH组的LVEF和LVFS显著增加（t=-15.520、-15.080，均P<0.001）；比较干预前、后发现，干预后MI-IH组的LVEF和LVFS较干预前显著增加（均P<0.001），见图1。

图1 小鼠心脏LVEF及LVFS水平

2.3 IH对心肌组织纤维化的影响

Masson染色结果显示，红色区域代表正常心肌范围，蓝色代表心肌纤维化范围。与SHAM组相比，MI组及MI-IH组心肌纤维化明显增加（t=-29.682、-19.682，均P<0.001）；与MI组相比，MI-IH组心肌纤维化显著降低，差异具有统计学意义（t=9.547,P<0.001);SHAM-IH组和SHAM组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

图2 心脏组织Masson染色  

2.4 IH对MEK/ERK通路的影响

心肌组织蛋白质免疫印迹结果显示，MI组和MI-IH组ERK1/2、MEK蛋白与SHAM组相比没有差异（均P>0.05）；与SHAM组相比，MI的p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达增加（t=-3.729、-4.595，均P<0.05）；与MI组相比，MI-IH组p-ERK1/2、p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达降低（t=2.292、3.267、6.399，均P<0.05），见图3。

图3 蛋白质免疫印迹检测p-MEK、p-ERK1/2、cleaved caspase 3蛋白表达   

2.5 IH对细胞凋亡的影响

心肌组织Tunel染色结果显示，SHAM组和SHAM-IH组间的细胞凋亡水平差异无统计学意义（P>0.05）。与SHAM组相比，MI组凋亡阳性细胞数明显增多（t=-8.997,P<0.001）。与MI组相比，MI-IH组凋亡阳性细胞数明显减少（t=4.341,P<0.001），见图4。

图4 心脏组织Tunel染色

2.6 抑制MEK/ERK对H9C2细胞凋亡的影响

蛋白质印迹结果显示：H2O2组和H2O2+U0126组的ERK1/2、MEK蛋白与Con组相比，差异无统计学意义（均P>0.05）；与Con组相比，H2O2组p-MEK、cleavedcaspase3蛋白表达明显增加（t=-4.489、-3.606，均P<0.05）；与H2O2组相比，H2O2+U0126组的pERK1/2、p-MEK、cleaved caspase 3蛋白表达明显降低（t=3.599、9.692、6.607，均P<0.05），见图5。

图5 蛋白质免疫印迹检测p-MEK、p-ERK1/2、cleaved caspase 3蛋白表达   

3、讨论

3.1 IH干预改善MI小鼠的心功能及心肌纤维化

MI是由于动脉内壁斑块生成，心肌缺血缺氧产生的血管损伤、炎症等一系列反应的一种心血管疾病[20]。MI后的心肌胶原持续纤维化会严重损害心脏功能，最终发展为心力衰竭。研究表明，间歇性低氧可以减少MI面积，缓解心肌纤维化，增强运动能力[21]。在本研究中同样发现MI组心肌纤维化程度明显高于Sham组，而IH干预后，心肌纤维化程度明显降低，提示IH可改善心肌纤维化。

MI后胶原纤维增多导致的纤维化增多会影响心脏的收缩功能。LVEF是评估MI后左室收缩功能的重要指标，如LVEF<40%可预测急性MI的死亡率[22,23]。有研究证明IH作为一种无创的干预方式，可以改善心肌组织的舒缩功能[24]。为了探究IH对心脏功能的积极作用，本研究采用超声观察心脏功能，发现MI-IH组与MI组相比，LVEF、LVFS的升高具有统计学意义，提示IH干预4周可显著改善MI小鼠的左室收缩功能。

3.2 IH干预抑制MI小鼠的细胞凋亡

MI后心肌长期缺血缺氧会诱导细胞凋亡，而细胞凋亡则会影响心脏功能。在临床上，由于心肌细胞丢失是患者死亡率的主要决定因素，因此减少细胞凋亡是拯救心血管疾病的关键因素[25]。Caspases家族是细胞凋亡的启动者[26]，其中caspase3是细胞凋亡的主要蛋白酶之一。观察caspase 3活化水平可以反映细胞凋亡水平。本研究采用Tunel染色和蛋白免疫印迹检测细胞凋亡水平，MI后心肌细胞凋亡蛋白caspase3活化增多，Tunel阳性凋亡细胞数增加，而在IH干预4周后caspase 3活化明显减少，Tunel阳性凋亡细胞数降低。这些变化表明IH干预可以抑制心梗心脏的细胞凋亡水平，从而改善心脏结构和功能。

3.3 IH干预通过MEK/ERK通路改善抑制细胞凋亡

本课题组前期研究已证实，一定参数的IH对MI心脏的保护作用[3,4]，可以减少心肌纤维化，改善心功能。研究表明，MEK/ERK通路在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中扮演着至关重要的角色，它们可以调控细胞增殖、分化、凋亡等不同的生理过程[27]。而细胞凋亡是由MAPK信号通路介导的最显着的表型之一。研究表明，RGS5基因敲除小鼠MI后出现明显细胞凋亡，可能因为部分激活MAPK信号通路[28]。M1巨噬细胞衍生的细胞外囊泡激活MEK/ERK通路，增加了MI区域的凋亡细胞，降低了血管生长因子的表达，抑制MI后的血管生成和心肌再生[29]。橄榄苦苷通过抑制MEK磷酸化，显著抑制缺血再灌注大鼠的caspase 3的表达[30]。上述研究提示抑制MEK/ERK通路可以抑制细胞凋亡。蛋白印迹结果显示，与MI组相比，MI-IH组MEK、ERK磷酸化蛋白、cleaved caspase 3蛋白表达显著减少。但是MEK、ERK总蛋白水平未有统计学差异，表明IH通过下调MEK、ERK的表达，抑制细胞凋亡。U0126明显抑制了MEK、ERK的活化状态。在体外实验中，发现MEK/ERK抑制剂的使用可明显减少受损心肌细胞的caspase 3活化。这也证实了抑制MEK/ERK信号转导的激活会抑制细胞凋亡，从而加快MI的恢复。

综上所述，本研究通过体外和体内实验，发现小鼠MI后采用IH干预通过抑制心肌MEK、ERK1/2蛋白磷酸化，抑制细胞凋亡，改善心肌纤维化，从而产生心肌保护作用。本研究有望为临床MI后患者的心脏康复提供理论基础与分子机制。但MEK/ERK所调控的表型众多，充分认识MEK/ERK还需要进一步探索。

参考文献:

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基金资助:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK-060B); 天津市卫健委科技项目青年项目(TJWJ2023QN008);

文章来源:丁心语,王俊懿,黄传,等.间歇性低氧通过MEK/ERK信号改善小鼠心肌梗死后心功能恢复[J].天津医科大学学报,2024,30(04):350-355.