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脂质运载蛋白-2在急性心肌梗死发病过程中的变化

2021-02-07 267 上传者：管理员

摘要：目的：探讨脂质运载蛋白-2(lipocalin-2,Lcn-2)在急性心肌梗死(AMI)过程中的变化及其临床意义。方法：分别采集100例AMI患者行经皮冠状动脉介入(PCI)治疗前及PCI治疗后24h、72h外周血，30例健康受试者外周血作为对照。分离血浆及中性粒细胞;分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)及RT-qPCR法检测血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平。选取12周龄25～30g的C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华)16只用于制备AMI模型。通过开胸结扎左冠状动脉前降支建立小鼠AMI模型(n=8)。分别取模型组小鼠结扎前及结扎1h、24h外周血，检测血浆及外周血中性粒细胞Lcn-2水平。此外，采用Lcn-2抗体对该模型进行干预，对结扎24h后小鼠进行心功能检测，并采用TUNEL法和免疫荧光检测心脏梗死区心肌凋亡情况及中性粒细胞浸润情况。结果：与健康受试者比较[血浆Lcn-2(20.35±8.51)ng/mL，中性粒细胞Lcn-2(1.03±0.16)倍]，AMI患者PCI治疗前Lcn-2水平[血浆(113.55±22.73)ng/mL，中性粒细胞(16.81±3.83)倍]明显升高，PCI治疗后24h[血浆(74.26±14.36)ng/mL，中性粒细胞(10.86±2.71)倍]、72h[血浆(46.81±12.83)ng/mL，中性粒细胞:(6.15±1.92)倍]依次明显下降。在小鼠模型上，与结扎前比较[血浆Lcn-2(8.14±2.33)ng/mL，中性粒细胞Lcn-2(1.01±0.08)倍]，小鼠结扎1hLcn-2水平[血浆(17.33±6.19)ng/mL，中性粒细胞(12.86±5.66)倍]、24h[血浆(35.15±10.44)ng/mL，中性粒细胞(20.17±7.14)倍]依次明显升高。与模型组比较[左心室舒张末期容积(LVEDV)(143.25±10.29)μL，左室射血分数(LVEF)(40.35±5.10)%，左室缩短分数(LVFS)(20.16±2.64)%],Lcn-2抗体干预明显改善了小鼠的心功能[LVEDV(123.25±9.35)μL,LVEF(49.37±6.69)%,LVFS(24.79±3.40)%]。此外，Lcn-2抗体干预明显抑制心肌细胞凋亡。结论：血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平与AMI发生相关，靶向抑制Lcn-2对AMI有明显的保护作用。

关键词：
中性粒细胞
心肌凋亡
急性心肌梗死
脂质运载蛋白
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急性心肌梗死(AMI)由于其高发病率和病死率，严重影响着人类生命安全及生活质量。在我国每年新发AMI患者大约有65万人，但是仅有接近30%的患者能够得到有效治疗[1]。缺血会导致心肌细胞凋亡，心肌细胞作为心脏最重要的细胞类型，覆盖了大约75%的心脏体积，一旦损失是无法自然再生。而且“救治延迟”现象引发的心肌细胞死亡及心室重构是导致AMI高病死率及致残率的主要原因[2,3]。心室重构能够引发AMI患者的心脏功能严重受损，继而直接影响AMI患者预后，增加患者的病死率及致残率[4]。因此，探寻AMI早期心室重构的生物标志物，探究AMI发病机制继而明确AMI过程调控心肌细胞凋亡的生物分子，对缓解AMI病情和预后是十分必要的。脂质运载蛋白-2(lipocalin-2,Lcn-2)是一个25kDa蛋白。多种组织及免疫细胞尤其是中性粒细胞能够大量分泌表达Lcn-2[5]。有研究[6,7]表明，Lcn-2参与调控中性粒细胞引发的炎症反应，在心血管疾病中扮演重要角色，但是其在AMI发病过程中的作用尚不得知。本研究在临床AMI患者和小鼠AMI模型上探究Lcn-2在AMI发病过程中的作用。

1、材料与方法

1.1临床资料

选择2017年1月至2019年8月急诊行经皮冠状动脉介入术(PCI)的ST抬高性心肌梗死(STEMI)患者100例。男69例，女31例。年龄30～74(46.3±13.5)岁。入选本研究者均同时符合以下纳入标准:(1)25～80岁:(2)诊断符合2015年中华医学会心血管分会修订的急性ST段抬高性心肌梗死诊断标准;(3)PCI成功(判定标准:目标血管残余狭窄少于20%，靶血管远端前向血流TIMI3级，无严重并发症)。排除标准:(1)恶性肿瘤、自身免疫性疾病;(2)肝肾功能不全;(3)对造影剂等过敏;(4)研究者认为不适合入选的其他情况。30例健康受试者作为对照，其中男16例，女14例，年龄30～57(43.5±13.9)岁。本研究经海口市120急救中心伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2小鼠AMI模型制备

选取12周龄25～30g的C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华)16只用于制备AMI小鼠模型。小鼠使用异氟烷麻醉后俯卧固定于手术台，消毒后连接小鼠呼吸机，在胸骨左侧做纵向切口暴露第四根肋骨，撕开心包暴露心脏。使用6-0号线在左前冠脉降支的源头处3mm左右结扎，挤出气体后缝合。所有动物实验经海口市120急救中心伦理委员会批准。

1.3Lcn-2检测

采集AMI患者PCI治疗前、PCI治疗后24h和72h外周血，以及健康受试者外周血;收集AMI小鼠模型结扎前及结扎1h、24h外周血。离心分离血浆，采用Percoll法分离中性粒细胞:15mL的离心管中依次加入1.5mL78%、69%、52%Percoll分离液，然后加入1mL外周血，离心2000r/min,20min。收集69%和78%分离液之间的细胞，即为中性粒细胞。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测受试者和小鼠血浆中Lcn-2水平，具体方法参照Lcn-2ELISA试剂盒说明书(R&Dsystem)。采用Trizol法提取中性粒细胞中RNA，然后反转录获得cDNA，采用RT-qPCR检测受试者和小鼠中性粒细胞中Lcn-2mRNA表达水平。人Lcn-2qPCR引物:上游5'-CAGAAGGCAGCTTTACGATG-3'，下游5'-CCTGGAGCTTGGAACAAATG-3';鼠Lcn-2qPCR引物:上游5'-CGGGAGGCTTCATTCAGTAG-3'，下游5'-CTGAGGCTGGTTCACAATGA-3'。

1.4Lcn-2抗体治疗

制备AMI小鼠模型，分成两组:Lcn-2干预组和模型对照组(每组8只)。Lcn-2治疗组每只小鼠在结扎前给予75μg抗Lcn-2抗体(R&Dsystem)，模型对照组给予相同量的IgG。结扎24h后，采用小动物超声成像系统(VevoLAZR)对小鼠心功能进行检测，并对各组小鼠左心室舒张末期容积(LVEDV)、左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)进行分析。之后取各组小鼠心脏组织，10%福尔马林固定后，使用OCT将心脏梗死区进行包埋，制备冰冻切片。使用TUNEL检测试剂盒(ABPBiosciences)检测梗死区心肌细胞凋亡情况，具体方法参考TUNEL检测试剂盒使用说明书。同时使用免疫荧光法检测各组梗死区心肌组织中中性粒细胞浸润情况:取冰冻切片，使用95%乙醇固定组织，山羊血清(中杉金桥)进行固定，然后使用兔抗鼠Ly6G抗体4℃孵育过夜，洗片后再使用AlexFlour594-抗兔二抗室温孵育1h;DAPI封片，荧光显微镜下观察拍照。

1.5统计学处理

采用GraphPad8.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差描述，先进行正态检验，若服从正态分布，两组资料之间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析;若不服从正态分布，则选择非参数秩和检验。采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1AMI患者PCI前后血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平变化

与健康受试者比较，AMI患者PCI治疗前血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平明显升高(P<0.01)，而PCI治疗后24h、72h血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平依次明显下降(P<0.05)，见表1。

表1AMI患者PCI前后血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平变化

2.2AMI小鼠模型血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平变化

与结扎前比较，小鼠结扎后1h、24h血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平依次明显升高(P<0.05)，见表2。

表2AMI小鼠模型血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平变化

2.3Lcn-2抗体干预对AMI小鼠心功能的影响

小鼠血浆及中性粒细胞Lcn-2水平分别与LVEDV呈正相关(r=0.7004,P<0.01;r=0.7411,P<0.01)，见图1。

图1AMI小鼠模型血浆及中性粒细胞Lcn-2与LVEDV的相关性分析

图2Lcn-2抗体干预对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡的影响

图3Lcn-2抗体干预对心肌梗死小鼠心肌中性粒细胞浸润的影响

与AMI小鼠模型比较，Lcn-2抗体干预明显降低了小鼠LVEDV，升高了小鼠LVEF和LVFS(P<0.05)，见表3。

表3Lcn-2抗体干预对AMI小鼠模型心功能的影响

2.4Lcn-2抗体干预对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL检测结果发现，Lcn-2抗体干预组小鼠梗死区细胞凋亡数目明显少于模型对照组(P<0.05)，见图2。

2.5Lcn-2抗体干预对心肌梗死小鼠心肌中性粒细胞浸润的影响

免疫荧光染色结果发现，Lcn-2抗体干预组小鼠梗死区中性粒细胞数目明显少于模型对照组(P<0.05)，见图3。

3、讨论

AMI主要是由于冠状动脉粥样硬化中的不稳定斑块脱落，进入血管中，继而导致心脏血管堵塞，最终导致心肌缺血，使心肌细胞发生不可逆性的损伤及心室重构。心室重构是慢性心力衰竭发生、发展的主要病理基础，是影响发病率和病死率的决定因素。心室重构越严重，心脏疾病的预后越差，并最终导致心力衰竭及死亡的发生。在分子细胞水平上，心室重构过程主要表现为炎症细胞浸润、炎性因子分泌增加及各种酶类生长因子大量表达，继而引发心肌细胞肥大、凋亡及纤维化等病理转化[8,9]。因此，探索AMI发病过程中影响心肌损伤及心室重构的分子对AMI患者的治疗及预后尤为重要。

Lcn-2是脂质运载蛋白家族成员，被发现与多种疾病具有相关性。在2型糖尿病患者体内，血清中Lcn-2水平明显升高，且Lcn-2水平与患者胰岛素抵抗呈正相关[10,11]。在自身免疫疾病如成人斯蒂尔病患者体内，中性粒细胞来源的Lcn-2水平明显升高，且Lcn-2可作为评判斯蒂尔病患者肝损伤程度的生物标志物[12]。此外，近些年研究[7]表明，Lcn-2水平在缺血-再灌注损伤过程中明显升高，且抑制Lcn-2能够明显抑制缺血-再灌注过程中性粒细胞浸润并改善心功能。中性粒细胞在AMI发病早期扮演重要坏角色。AMI大量的中性粒细胞第一时间进入心脏梗死区清除细胞碎片，然而同时中性粒细胞会分泌大量炎症因子诱发组织损伤和招募其他炎症细胞进入梗死区域[13]。Lcn-2在中性粒细胞激活过程中扮演重要角色[14]。本研究对AMI患者PCI干预前后血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平进行检测，发现发生AMI时患者血浆Lcn-2及中性粒细胞Lcn-2水平明显升高。PCI后血浆及中性粒细胞中Lcn-2水平随时间推移明显下降，表明Lcn-2可能参与AMI的发病过程，检测Lcn-2水平可作为AMI患者预后的一个评判标准。

进一步在小鼠AMI模型上研究发现，发生心肌梗死后，小鼠血浆和中性粒细胞中Lcn-2水平明显升高，且随心肌梗死发生时间延长而明显增加。相关性分析显示，LVEDV分别与血浆Lcn-2水平和中性粒细胞Lcn-2水平呈正相关，表明Lcn-2参与AMI心室重构。进一步研究表明，Lcn-2有望成为AMI病情及预后的生物标志物。体外实验研究[15]表明，Lcn-2可通过调节心肌细胞内铁离子的水平，进而调节凋亡蛋白Bax表达，诱导心肌细胞凋亡。此外，Lcn-2还与金属蛋白酶(MMPs)高度相关，其与MMPs相结合形成的异源二聚体为其在体内存在的主要形式之一，而MMPs在心肌梗死过程中的心室重构过程发挥重要作用[16]。AMI小鼠使用Lcn-2抗体干预明显改善心肌梗死后心功能，表现为更小的LVEDV，更高的LVEF及LVFS。通过比较两组小鼠心脏LVEF和LVEDV来评估心室重构程度，显示Lcn-2抗体干预明显抑制了心肌梗死过程心室重构。进一步研究发现，Lcn-2抗体干预明显抑制心肌细胞凋亡及中性粒细胞向心肌组织中浸润。鉴于中性粒细胞在AMI发病过程中的作用，本研究推测，AMI发生促进中性粒细胞激活，继而表达分泌Lcn-2,Lcn-2转而进一步促进中性粒细胞向心肌组织中浸润，进入心肌组织的中性粒细胞继而分泌促炎因子及Lcn-2，引发心肌损伤，促进心肌重构，最终引发心功能衰竭。这些结果表明Lcn-2参与AMI的发病过程。

综上所述，血浆和中性粒细胞Lcn-2可以作为AMI病情及预后的一个新生物标志物。Lcn-2可能通过调节中性粒细胞分泌炎症因子，继而促进心肌细胞凋亡及心室重构，加剧AMI病情。本研究明确了Lcn-2参与AMI发病过程，为AMI临床防治提供了新思路。

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