急性心肌梗死(AMI)是一种由于冠状动脉斑块破裂、形成血栓阻塞血管、最后引起急性心肌缺血性损伤的疾病,现已成为严重威胁人类健康的主要原因之一[1]。目前针对AMI的治疗主要包括经皮冠状动脉介入术联合抗血小板和(或)抗凝治疗完成血运重建及调脂稳定斑块,但是AMI患者的发病率和死亡率仍然居高不下。因此,进一步研究AMI的发病机制,寻找新的诊疗分子靶点具有重要的意义。长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,最初人们因为lncRNA不具编码蛋白质的功能被认为是“生物垃圾”[2]。近年来随着人们对lncRNA研究的不断深入,循环血浆或血清lncRNA作为新型生物标记物在疾病诊断、预后或治疗中发挥重要作用。因此,本研究拟通过基因芯片分析AMI患者血清lncRNA的表达,探索lncRNA能否作为一种新型生物标记物参与AMI的发生发展,为临床AMI治疗寻找新靶点。

1、资料和方法

1.1研究对象

本研究连续入组2018年12月至2020年6月在南方医科大学南方医院心血管内科就诊并首次行冠状动脉造影者130例,包括非冠心病(non-coronaryheartdisease,non-CHD)组65例,AMI组65例,其中外送lncRNA基因芯片分析non-CHD组和AMI组各5例,我们自己后续lncRNA检测分析non-CHD组和AMI组各60例。AMI组中包括急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segmentelevationmyocardialinfarction,STEMI)40例和急性非ST段抬高型心肌梗死(non-ST-segmentelevationmyocardialinfarction,NSTEMI)25例。排除标准:严重的肝肾功能损害、重症感染性疾病、心力衰竭、严重的心脏瓣膜疾病、严重心律失常、恶性肿瘤、血液系统性疾病和自身免疫系统疾病。本研究经过患者同意并签署知情同意书,经南方医科大学南方医院临床研究伦理委员会批准。

诊断标准:根据卫生部2010年11月发布的冠心病诊断标准,结合临床表现、病史、心电图及冠状动脉造影结果证实至少1支心外膜冠状动脉或其主要分支内径狭窄≥50%的患者诊断为冠心病;冠状动脉造影证实冠状动脉主支狭窄<50%者诊断为non-CHD;AMI根据2018年欧洲心脏病学会(EuropeanSocietyofCardiology,ESC)发布的诊断标准诊断。

1.2一般资料和临床生物化学指标收集

对所有纳入的研究对象收集一般资料包括年龄、性别、临床表现(主要症状和体征)、吸烟史、高血压史及糖尿病史。临床生物化学指标包括入院后血常规、N末端B型脑钠肽原(N-terminalpro-B-typenatriureticpeptide,NT-proBNP)、C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)、心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatinekinaseisoenzyme-MB,CK-MB)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)、血肌酐(serumcreatinine,SCr)、尿酸(uricacid,UA)、D-二聚体、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDLC)、糖化血红蛋白(hemoglobinA1c,HbA1c)。

所有患者行冠状动脉造影后,用含肝素钠的促凝管收集次日清晨空腹静脉血5mL,室温静置30～60min后3000r/min离心15min,收集血清置于-80℃备用。

1.3冠状动脉造影

冠状动脉造影术由南方医院心内科导管专业医师在标准导管室完成,采用Judkins法行左、右冠状动脉造影,由至少2名有经验的医师评估冠状动脉狭窄程度。主要的冠状动脉包括:左主干、左前降支、左回旋支及右冠状动脉、第1对角支、第2对角支、钝缘支、左心室后支、后降支。

1.4lncRNA基因芯片分析

本研究的RNA提取及检测,部分委托上海其明信息技术有限公司进行,采用人类全转录组芯片2.0(humantranscriptomearray2.0,HTA2.0)技术分析5例STEMI和5例non-CHD外周血清中lncRNA差异表达谱,用limma包进行差异基因分析,计算转录本间的显著性水平(P值)及倍数变化(foldchange)。

1.5RNA提取和实时荧光定量PCR

血清RNA、细胞RNA提取分别用TrizolLS法、Trizol法。分光光度计测量RNA浓度,当A260nm/A280nm在1.8～2.2之间时视为合格样本。逆转录试剂盒(Takara公司,RRO36A)对RNA进行逆转录得到cDNA。用实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)试剂盒(Takara公司,RR420)配制PCR的反应体系,按试剂盒说明书设置反应程序,用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测RNA的表达情况。以GAPDH作为内参,根据2-ΔΔCT计算相对表达量。实验qRT-PCR所需引物序列由上海生工生物工程公司完成,见表1。

表1.qRT-PCR所需的引物序列

1.6细胞培养和干预

JurkatT细胞用含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中进行培养,隔2天换液。对数生长期T细胞用无血清培养基培养6～8h,按细胞密度1×109/L接种,再加入1mg/L抗CD3/CD28单克隆抗体培养24h活化T细胞。对照组均用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)干预。

1.7病毒转染

实验用的lncRNAn342721过表达病毒购于上海吉凯基因科技有限公司,实验方法按照生产商说明书进行。用完全培养基制备5×107/L的对数生长期细胞悬液,再根据细胞转染复数(multiplicityofinfection,MOI)(20,30,50,70,100)及病毒滴度加入相应的病毒量,继续培养12h后更换完全培养基。转染约72～96h用显微镜观察转染效率,根据转染情况矫正MOI并选择最佳MOI进行后续实验。计算公式:病毒体积=MOI×细胞密度/病毒滴度。

1.8小干扰RNA转染

实验用lncRNAn342721小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)购于广州锐博生物科技有限公司,包括小干扰RNA对照(siNC),lncRNAn342721小干扰1(siRNA1,GAAATTGGCATACATTTTG)、小干扰2(siRNA2,TGTCGTAAAGTGCTGAAGT)和小干扰3(siRNA3,TGACAGAGATTTGCTACAT)。用培养基Opti-MEM(Gibco公司,31985-070)制备5×108/L的对数生长期细胞悬液,Lipo2000(Invitrogen公司,11668-019)转染siRNA于6孔板,转染终浓度为100nmol/L,实验方法按照生产商说明书进行。转染6～8h后更换为含10%FBS的RPMI-1640培养基,继续培养48h,用qRT-PCR检测siRNA沉默效果。

1.9统计学方法

采用SPSS25.0软件对数据进行统计分析,用GraphPadPrism8.0软件对数据进行绘图。计量资料以x¯±s表示,所有数据进行正态性检验,服从正态分布的两组数据间比较采用独立样本t检验;不服从正态分布的两组数据间比较采用非参数Mann-Whitney检验。计数资料采用χ2检验。单因素或多因素采用二分类Logistic回归分析。所有P值采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1AMI患者血清存在差异表达lncRNA

对5例STEMI和5例non-CHD血清lncRNA采用HTA2.0技术检测,在检测的20474个lncRNA中,采用limma包筛选出625个差异有统计学意义的lncRNA(P<0.05)。根据倍数变化>1.2或<0.833,发现与non-CHD相比,STEMI患者血清差异表达lncRNA中有296个上调,74个下调,结果如图1A(分层聚类)和图1B(火山图)所示。患者一般资料见表2。

图1.HTA2.0分析分层聚类图(A)和火山图(B)

2.2AMI患者血清lncRNAn342721表达明显升高

在上述AMI患者明显上调的lncRNA中,我们根据表达倍数筛选出上调明显的6个lncRNA进一步研究,分别为lncRNAn342721、n340998、n335659、TCONS_l2_00021878-XLOC_l2_011118、TCONS_00029192-XLOC_013851、TCONS_00000119-XLOC_000001(以下依次简写为n342721、n340998、n335659、TCONS011118、TCONS013851、TCONS000001)。我们通过qRT-PCR在20例non-CHD和20例AMI患者外周血血清进一步验证了筛选的lncRNA表达。与non-CHD组相比,AMI组除lncRNAn335659的表达无明显统计学差异外(P=0.085;图2C),其他5个lncRNA:n342721、n340998、TCONS011118、TCONS013851、TCONS000001的表达分别增加2.42、1.56、1.60、1.95、1.94倍(图2A、B、D、E、F),差异均有统计学意义,且与芯片结果一致。患者一般资料如表3所示。

表2.用于HTA2.0的一般临床资料

图2.lncRNA在AMI组、non-CHD组血清中的表达

表3.小样本验证的一般临床资料

2.3lncRNAn342721与T细胞功能密切相关

AMI由动脉斑块破裂和缺血性损伤引起,动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是其根本原因[3]。免疫细胞参与慢性炎症反应、异常胆固醇逆向转运(reversecholesteroltransport,RCT)进而促发形成血管壁动脉斑块是As发病的主要机制[4,5]。T细胞作为主要的免疫细胞参与As的形成[6,7],与AMI发生发展密切相关。

我们在细胞水平活化T细胞后通过qRT-PCR检测lncRNA的表达。如图3A所示,与对照组相比,T细胞活化后lncRNAn342721差异最大,趋势与血清一致。因此,我们推测血清lncRNAn342721可能来源于T细胞。

为了继续探讨lncRNAn342721在T细胞中发挥的生物学功能,我们体外构建lncRNAn342721过表达慢病毒和siRNA,用qRT-PCR确认转染效率。当MOI=50时病毒转染T细胞效率可以达到90%以上(图3B)。转染慢病毒后,过表达组(LV-OE)lncRNAn342721的表达比空白对照组(PBS)和慢病毒空载体组(LV-NC)增加约31倍[(31.710±2.610)比(1.000±0.006),(31.710±2.610)比(1.140±0.011),P<0.001;图3C]。我们用抗CD3/CD28单克隆抗体活化T淋巴细胞后通过qRT-PCR检测细胞炎症指标白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)和RCT指标肝X受体β(liverXreceptorβ,LXR-β)、ATP结合盒转运体A1(ATPbindingcassettetransporterA1,ABCA1)、ABCG1的mRNA水平变化(图3D),与对照组(PBS和LV-NC)相比,LV-OE组促炎因子TNF-α、IL-6mRNA水平明显升高(分别对应图3E、F),抑炎因子IL-10(图3G)和RCT指标LXR-β、ABCA1、ABCG1mRNA明显降低(分别对应图3H、I、J)。

转染siRNA沉默lncRNAn342721后发现,与siNC相比,siRNA1、siRNA2、siRNA3均可抑制lncRNAn342721的表达,其中siRNA2抑制效果最好(图4A),我们选择siRNA2进行后续研究。与对照组(PBS和siNC)相比,siRNA2组促炎因子TNF-α、IL-6mRNA水平明显降低(分别对应图4B、C),抑炎因子IL-10(图4D)和RCT指标LXR-β、ABCA1、ABCG1mRNA明显升高(分别对应图4E、F、G)。

图3.过表达lncRNAn342721后炎症因子和胆固醇转运因子表达

图4.沉默lncRNAn342721后炎症因子和胆固醇转运因子表达

2.4lncRNAn342721作为生物标志物的临床潜能

为了进一步探讨lncRNAn342721在AMI患者中作为生物标志物的临床潜能,我们对收集的60例non-CHD和60例AMI患者血清通过qRT-PCR检测lncRNAn342721的表达(两组一般资料见表4)。如图5所示,AMI患者血清lncRNAn342721水平明显高于non-CHD组[(2.37±1.97)比(1.56±1.58),P=0.014]。我们随后对临床指标及lncRNAn342721进行单因素和多因素Logistic回归分析以探讨其临床价值,结果表明循环lncRNAn342721与AMI的发生密切相关(表5)。

图5.lncRNAn342721在AMI组、non-CHD组血清中的表达

表4.两组一般资料比较

表5.二分类Logistic回归分析

3、讨论

尽管在过去的30年人类死亡率呈下降趋势,AMI仍然是最严重的心脏事件,目前的治疗策略包括冠状动脉血管再通、抗血小板、抗凝、降低LDLC水平,但AMI发病率和死亡率依旧居高不下。人类基因组研究发现超过95%的基因缺乏编码蛋白质的潜力[8],lncRNA为其中一类,同样缺乏编码潜力。然而,最近越来越多的证据表明lncRNA可通过表观遗传学、转录前或转录后调控机制参与疾病发生过程,甚至一些lncRNA已被用作生物标志物,如前列腺癌患者尿液中lncRNAPCA3[9]和血浆中MALAT-1[10],大肠癌患者组织中lncRNAHOTAIR[11]。不仅如此,lncRNA也参与心血管疾病的病理生理改变,在心肌病或心力衰竭患者的心脏或血液循环中lncRNA表达也会发生变化,甚至可以预测患者预后[12,13]。综上,lncRNA有可能作为诊疗AMI的分子靶点,为临床工作提供新思路。

我们采用HTA2.0分析AMI和non-CHD两组循环lncRNA的表达,发现存在lncRNA差异表达谱。与non-CHD相比,AMI患者血清中差异表达的lncRNA有296个上调,74个下调。寻找差异表达lncRNA来源,探索可能的分子机制,有望为AMI诊疗提供新的有效方法。

为了探索lncRNAn342721的临床价值,我们检测血清lncRNAn342721的表达,发现在AMI和non-CHD中存在差异,通过单因素和多因素Logistic回归分析发现血清lncRNAn342721与AMI的发生密切相关。

动脉粥样硬化是AMI发病的根本原因,免疫细胞始终伴随和参与As的发生发展。免疫细胞炎症反应、异常脂质代谢和胆固醇沉积与血管壁斑块形成密切相关,在As的发病机制中起重要作用[5,14,15]。此外,研究表明免疫细胞可直接影响AMI梗死面积大小和心室重塑[16]。Fernandez等[17]对46例As患者进行单细胞测序,发现血液及斑块中T细胞是启动免疫反应的主要细胞群,表明T细胞与AMI发生密切相关。

我们在细胞水平活化T细胞后检测细胞lncRNA的表达,发现筛选的6个上调lncRNA在血清的水平与在T细胞中的表达水平呈正相关。我们筛选差异最大的lncRNAn342721作为主要研究对象,结合上述研究我们推测AMI患者血清lncRNA可能来源T细胞。

T细胞通过不断产生TNF-α、IL-6等炎症因子放大炎症反应,此外T细胞不仅是启动免疫炎症反应的主要细胞群,而且与脂质代谢密切相关[18]。我们团队之前研究证实,T细胞的炎症反应伴随着胆固醇积累,活化的T细胞会促进炎症因子的表达、降低胆固醇外排能力和增加细胞内胆固醇含量[19,20]。因此,靶向涉及细胞内炎症和脂质代谢作用的干预将可能为AMI提供新的治疗方法。

在本次研究中,我们发现转染lncRNAn342721过表达慢病毒后可以明显促进T细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达,减少抑炎因子IL-10和RCT指标ABCA1、ABCG1、LXR-β表达,当抑制T细胞内lncRNAn342721表达后,上述炎症因子表达降低,抑炎因子和RCT指标增加。研究证实炎症和胆固醇代谢可以双向调节,RCT可以通过影响细胞内胆固醇水平干扰脂筏流动进而抑制炎症反应,LXR可调控胆固醇代谢基因ABCA1、ABCG1的表达,在维持胆固醇稳态中发挥重要作用,同时LXR是连接炎症与胆固醇代谢之间的重要桥梁[21]。在本研究中lncRNAn342721过表达后可以抑制LXR-β的表达,进而抑制ABCA1、ABCG1水平及促进炎症因子TNF-α和IL-6表达,二者共同促进As发生,提示沉默lncRNAn342721对减轻炎症反应和促进RCT具有潜在的临床益处。但是lncRNAn342721在炎症与胆固醇双向调节的具体机制如何,在原代初始T细胞水平是否具有影响T细胞向不同表型分化的作用,以及在动物水平的进一步验证还有待深入研究。

综上所述,本研究有如下发现:(1)AMI患者血清中lncRNAn342721的表达明显升高;(2)体外活化T细胞可促进lncRNAn342721表达;(3)lncRNAn342721过表达后可促进炎症因子和抑制RCT指标表达,沉默后可抑制炎症因子和促进RCT指标表达;(4)循环lncRNAn342721与AMI的发生密切相关,可作为新的生物标志物。

本研究发现在AMI患者血清中lncRNAn342721表达水平显著升高,与活化的T细胞表达呈正相关,推测T细胞可能是AMI患者血清lncRNAn342721的主要来源。我们验证了lncRNAn342721在T细胞中的功能,过表达lncRNAn342721明显促进炎症因子和抑制胆固醇转运因子的表达,沉默后可抑制炎症因子和促进RCT因子表达。我们得出结论:lncRNAn342721可能来自血液中T细胞,可通过促进炎症反应、抑制胆固醇转运参与AMI发生发展;同时循环lncRNAn342721与AMI的发生密切相关,有望成为AMI治疗的潜在新靶点。

参考文献：

[4]尹凯,唐朝克.炎症调控胆固醇逆向转运的机制研究[J].中国动脉硬化杂志,2018,26(7):655-657.

[7]冯娟,吕思霖,王宪.T淋巴细胞代谢重塑与动脉粥样硬化发病[J].中国动脉硬化杂志,2019,27(1):1-8.

刘丹,颜福欣,郭中州,郎吉萍,戴秋月,林立龙,曹世平.血清长链非编码RNAn342721在急性心肌梗死患者中的表达及意义[J].中国动脉硬化杂志,2021,29(03):206-216.

基金:国家自然科学基金青年项目(81900398､81700388);广东省自然科学基金面上项目(2019A1515010666);广东省教育厅高水平大学建设经费南方医科大学临床研究启动计划(LC2016PY002);南方医科大学南方医院临床研究专项(2018CR051)