首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 急诊科论文 > 急性心肌梗死论文 > 五味子乙素对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡的影响

五味子乙素对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡的影响

2024-04-14 49 上传者：：五味子乙素;心肌梗死;心肌细胞;炎症反应;核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性通路;

摘要：目的研究五味子乙素对心肌梗死大鼠的保护作用及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(10 mg·kg-1卡托普利)、低剂量实验组(30 mg·kg-1五味子乙素)、高剂量实验组(60 mg·kg-1五味子乙素),每组10只，连续给药14 d后检测心功能相关指标。以试剂盒检测血清心肌损伤标志物及血清炎症因子水平，以原位末端标记(TUNEL)法和蛋白质印迹法分别检测大鼠心肌细胞凋亡和相关蛋白的表达水平。结果假手术组、模型组、阳性对照组、低剂量实验组、高剂量实验组大鼠的左心室射血分数(LVEF)水平分别为(78.42±4.32)%、(41.65±2.94)%、(59.76±5.35)%、(49.13±3.92)%和(67.04±3.00)%,肌酸激脢同工酶(CK-MB)含量分别为(33.95±2.68)、(100.51±3.92)、(48.27±3.70)、(70.34±2.93)和(49.13±3.67)U·L-1,白细胞介素-1β(IL-1β)水平分别为(1.02±0.12)、(3.02±0.20)、(1.61±0.13)、(2.33±0.26)和(1.34±0.14)ng·mL-1,TUNEL阳性细胞率分别为(3.47±0.82)%、(31.79±3.68)%、(11.22±1.02)%、(19.74±1.42)%和(14.38±1.13)%,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)蛋白相对表达水平分别为0.35±0.07、1.04±0.10、0.55±0.05、0.85±0.07和0.39±0.06,胱天蛋白酶-1(caspase-1)蛋白相对表达水平分别为0.34±0.05、1.05±0.10、0.50±0.06、0.72±0.05和0.46±0.03;模型组的上述指标与假手术组比较，阳性对照组、低剂量实验组、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，高剂量实验组的上述指标与低剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论五味子乙素可介导炎性反应和心肌细胞凋亡，改善心功能，对心肌梗死大鼠起到保护作用，与NLRP3炎性通路相关。

关键词：
五味子乙素
心肌梗死
心肌细胞
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性通路
炎症反应
加入收藏

心血管疾病仍然是世界范围内死亡的首要原因，心肌梗死是一种致命的心血管疾病，全世界每年有数百万人死亡，近年来其发病率和死亡率一直居高不下[1]。五味子乙素是从中药五味子提取的主要活性成分之一，五味子具有护肝、抗癌、抗炎等药理作用[2]。五味子乙素可介导氧化应激途径，保护心肌功能，改善急性心肌缺血损伤[3]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nod-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体已被证实与急性心肌梗死密切相关，NLRP3炎性小体的激活可加速下游促炎因子的释放并诱导机体发生炎症反应[4]。本研究通过构建心肌梗死大鼠模型，探讨五味子乙素在心肌梗死大鼠中的作用机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性SD大鼠，鼠龄6～7周，体质量180～220 g,购自厦门大学。动物生产许可证号：SCXK(闽)2023-0003。本研究经泉州市第一医院伦理委员会批准(伦理批号：20221228)。

药品与试剂五味子乙素，规格：每瓶20 mg,纯度：98%,批号：20220125,上海户实医药科技有限公司生产；卡托普利，规格：每片25 mg,批号：20211120,批准文号：国药准字H46020504,海南普利制药股份有限公司生产。原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)试剂盒，上海泽叶生物科技有限公司生产；肌酸激脢同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)试剂盒，均为上海梵态生物科技有限公司生产；白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-18,均为上海联迈生物工程有限公司生产；IL-1β,上海齐一生物科技有限公司生产；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated spot-like proteins, ASC)、胱天蛋白酶-1(cysteine aspartic acid specific protease 1,caspase-1)抗体，均购自英国Abcam公司。

仪器MYLAB X5 VET大鼠心脏超声系统，上海玉研科学仪器有限公司产品；xMark酶标仪，美国伯乐公司产品；MF53-N倒置荧光显微镜，广州明美公司产品；DHX动物呼吸机，成都仪器厂产品；ZL-E3小动物心电图机，安徽耀坤生物科技有限公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]5]

所有大鼠均饲养在清洁级动物房中，温度为22～24℃,湿度为50%,12 h黑暗/12 h光照，自由进食饮水。所有大鼠适应性饲养1周后，根据结扎冠状动脉前降支法建模，将大鼠麻醉后，接通呼吸机并连接心电图；消毒后剔除胸部及腋下毛发，使用手术剪切开胸部皮肤暴露心脏，并充分暴露冠状动脉前降支，在其根部3 mm处用缝合线进行结扎并观察心电图和大鼠心脏表面颜色，大鼠心肌梗死模型构建成功表现为心脏发白且心电图指标异常(如ST段弓背抬高，T波高耸等),然后进行常规关胸处理，并进行防感染处理。假手术组大鼠开胸后只穿线，但不结扎。共建模成功40只大鼠。

2.2 动物分组与给药方法

随机选取10只大鼠作为假手术组，按照“2.1”方法进行操作，并将建模成功大鼠随机分为模型组、阳性对照组、低剂量实验组、高剂量实验组，每组10只。阳性对照组大鼠每天灌胃给予10 mg·kg-1卡托普利，低剂量实验组和高剂量实验组大鼠分别每天灌胃给予30、60 mg·kg-1五味子乙素，每天1次，假手术组及模型组均灌胃等体积0.9%NaCl,灌胃体积为10 mL·kg-1,连续给药14 d,在末次给药2 h后检测心功能相关指标，然后进行取材。

2.3 心功能检测[5]5]

将大鼠麻醉后固定于操作台上(仰卧位),然后用动物心脏超声机检测各组大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter, LVEDD)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening, LVFS)参数；并用血流动力学分析装置分析大鼠血流动力学，将肝素化盐溶液置入右侧颈动脉内，将导管插入左心室，测量左心室压力上升速度(dP/dt max)和下降速度(dP/dt min)。

2.4 血清心肌损伤标志物及血清炎症因子水平的检测[6]6]

所有大鼠检测心功能相关指标后，经腹主动脉采血，以3 000 r·min-1离心10 min后收集上清液，然后按照试剂盒说明书检测大鼠CK-MB、cTnⅠ水平及IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18水平。

2.5 TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况[7]7]

取各组大鼠心肌组织，用多4%聚甲醛进行固定，48 h后经常规脱水和石蜡包埋后，制作切片(4μm),然后取切片脱蜡水化，加入蛋白酶K溶液，在室温下孵育20 min后用过氧化氢(3%)室温孵育10 min,用磷酸盐缓冲液清洗后滴加抗荧光素抗体，然后用0.05%的二氨基联苯胺显色4 min后清洗，再用苏木精复染，10 min后经脱水、透明和封片。然后在光学显微镜下观察并拍照，凋亡细胞被染色为褐黄色和棕褐色。

2.6 蛋白质印迹法检测各组大鼠心肌组织相关蛋白的表达水平[8]8]

取各组大鼠心肌组织，加入裂解液提取总蛋白后进行蛋白进行定量，并取蛋白50μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，经脱脂牛奶(5%)室温封闭，2 h后，加入一抗稀释液孵育过夜(4℃),次日，TBST清洗后进行二抗孵育(稀释浓度为1∶2 000),然后滴加电化学发光显色液显色，并进行灰度值分析。Bax、Bcl-2、NLRP3、ASC、caspase-1一抗稀释比均为1∶1 000。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。数据用表示，2组间比较用LSD-t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 各组大鼠心功能指标的比较

阳性对照组大鼠每天灌胃给予10 mg·kg-1卡托普利；低剂量实验组和高剂量实验组大鼠分别每天灌胃给予30、60 mg·kg-1的五味子乙素；假手术组及模型组均灌胃0.9%NaCl。

模型组的LVEDD水平较假手术组显著升高，LVEF、LVFS、dP/dtmax、dP/dtmin水平均较假手术组显著降低(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组的LVEDD水平均显著降低，LVEF、LVFS、dP/dtmax、dP/dtmin水平均显著升高(均P<0.05);高剂量实验组的LVEDD显著低于低剂量实验组，LVEF、LVFS、dP/dtmax、dP/dtmin水平均显著升高(均P<0.05),见表1。

2 五味子乙素对MI大鼠炎症反应的影响

模型组血清相关促炎因子水平均较假手术组显著升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组及低、高剂量实验组血清促炎因子水平均显著降低(均P<0.05),高剂量实验组血清促炎因子水平均显著低于低剂量实验组(均P<0.05),见表2。

3 各组大鼠心肌损伤标志物的比较

与假手术组比较，模型组血清CK-MB和cTnⅠ水平均较假手术组显著升高，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05);阳性对照组及低、高剂量实验组血清CK-MB、cTnⅠ水平均较模型组显著降低，且高剂量实验组血清CK-MB和cTnⅠ水平均显著低于低剂量实验组(均P<0.05),见表2。

表1各组大鼠血流动力学参数及心动图相关指标的比较

表2各组大鼠血清炎症因子和心肌损伤标志物水平的比较

4 五味子乙素对MI大鼠心肌细胞凋亡的影响

如表3所示：模型组大鼠心肌细胞凋亡率及Bax蛋白相对表达水平均较假手术组显著提高，而Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组和低、高剂量实验组心肌细胞凋亡率及Bax蛋白相对表达水平均显著减少，且高剂量实验组进一步降低(P<0.05),Bcl-2蛋白相对表达水平均显著升高，且高剂量实验组进一步升高(P<0.05)。

表3各组大鼠心肌细胞凋亡及相关蛋白表达水平的比较

5 五味子乙素对MI大鼠心肌组织NLRP3炎性通路相关蛋白表达的影响

如表4和图1所示：模型组的NLRP3、ASC、caspase-1蛋白相对表达水平均较假手术组显著升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组及低、高剂量实验组的NLRP3、ASC、caspase-1蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05),且高剂量实验组的上述蛋白相对表达水平均较低剂量实验组进一步降低(均P<0.05)。

表4各组大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性通路相关蛋白表达水平的比较

图1以蛋白质印迹法检测各组大鼠心肌组织NLRP3炎性通路相关蛋白的表达情况

三、讨论

五味子是木兰科植物五味子干燥的成熟果实，又名北五味子，具有宁心安神和益气生津等功效，北五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素成分是五味子乙素，研究已经证实，五味子乙素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理功效[9]。研究表明，五味子乙素在心肌缺血再灌注大鼠模型中，可通过抑制心肌细胞凋亡改善模型大鼠心肌损伤[10]。这提示五味子乙素对心血管疾病也具有显著的保护作用，心肌梗死是全球心血管疾病中致死率最高的相关疾病之一。本研究观察到五味子乙素治疗后，心肌梗死大鼠心功能相关指标LVEDD、LVEF、LVFS、dP/dtmax、dP/dt min以及心肌损伤标志物CK-MB和cTnⅠ均得到显著改善，且呈剂量依赖，这提示五味子乙素可有效地改善心肌梗死大鼠心功能。

在本研究中，观察到心肌梗死大鼠血清中炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18)水平均显著升高，五味子乙素治疗后，促炎因子水平均显著降低，且高剂量实验组促炎因子降低水平优于低剂量组，同时还观察到五味子乙素治疗后心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率和Bax蛋白相对表达水平均显著降低，Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高，这提示五味子乙素可能通过抑制早期炎症反应，减轻心肌细胞凋亡，进而缓解大鼠心肌梗死。

研究表明，NLRP3炎症小体参与心肌梗死的进程[11]。当NLRP3活化后，可激活下游效应蛋白IL-18和IL-1β以及相关炎症介质，诱导炎症反应加重病情[11]。柏业军等[12]在研究中发现对大鼠心脏缺血再灌注处理后，大鼠NLRP3、ASC、caspase-1及促炎因子水平均显著增加。在本研究中也观察到心肌梗死大鼠心肌组织中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平均显著增加，五味子乙素处理后NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达均受到抑制，这提示五味子乙素可能通过抑制NLRP3/ASC/caspase-1通路对心肌梗死大鼠起到保护作用。

参考文献:

[2]白文宇,王厚恩,王冰瑶,等.五味子化学成分及其药理作用研究进展[J].中成药,2019,41(9):2177—2183.

[3]王媛,刘晟楠,马姣姣,等.五味子乙素对大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用[J].河北医药,2022,44(21):3216—3220.

[4]李继忠,李曼,魏鸾颍.NLRP3炎性小体在急性非ST段抬高心肌梗死中的作用及其与血栓积分的关系[J].中国急救医学,2022,42(5):436—440.

[5]张文强,李慧,朱芳红,等.丹参多酚酸盐通过SIRT3/β-catenin-PPARγ信号通路对心肌梗死大鼠的作用及机制研究[J].现代生物医学进展,2023,23(7):1225—1230.

[6]鄞晓斌,邱名耀,吴海琴,等.山柰酚通过下调PARP-1抑制炎症反应和心肌细胞凋亡改善心肌梗死大鼠心功能障碍的研究[J].中国医院用药评价与分析,2023,23(3):295—299.

[7]任欣伟,张卫国,聂玉真.黄芪甲苷通过CaMkkβ/AMPK通路对急性心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体自噬的作用机制研究[J].医药论坛杂志,2023,44(9):41—46.

[8]罗斌,田芳芳,田俊斌,等.白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响[J].世界中医药,2021,16(1):86—90.

[9]张译敏,廖秀玲,王雪妮,等.五味子乙素抗炎作用研究进展[J].中成药,2022,44(10):3244—3248.

[10]华海燕,严杰,秦宇芬.五味子乙素通过抑制心肌细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学,2022,27(8):848—856.

[12]柏业军,施佩辰,李志刚,等.降香通脉汤对心肌缺血再灌注大鼠炎症因子及NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路的影响[J].山西中医,2023,39(3):56—59.

文章来源:黄艳冰,陈伟文,黄燕龙,等.五味子乙素对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):999-1003.