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萝卜硫素激活ERK/NRF1信号通路改善心肌梗死心室重构的研究

2024-04-19 169 上传者：管理员

摘要：目的：探究萝卜硫素（SFN）通过激活细胞外调节蛋白激酶（ERK）/核呼吸因子1(NRF1)信号通路改善心肌梗死（MI）大鼠心室重构的效果。方法：48只SD雄性大鼠，随机挑选12只为假手术（Sham）组，剩余大鼠通过冠状动脉左前降支结扎术构建心肌梗死模型，造模后36只大鼠随机分为MI模型组、SFN治疗组（10 mg/kg）、SFN+SCH772984(ERK抑制剂)组（10 mg/kg+15 mg/kg），每组12只大鼠。采用心脏超声观察各组大鼠心肌结构和心脏功能，采用组织学切片染色观察心肌纤维化及心肌细胞凋亡情况，ELISA检测血清中的炎症因子表达，Western blot实验观察各组大鼠心肌组织中ERK/NRF1通路相关蛋白表达情况。结果：与Sham假手术组相比，MI模型组大鼠心肌结构紊乱、心肌功能和心脏顺应性下降，组织学上可见大量心肌纤维化组织和凋亡心肌细胞，同时血清中促炎因子水平升高而心肌中ERK/NRF1通路激活水平下降（P<0.05）。SFN给药治疗以后，SFN组大鼠心肌功能及顺应性明显增强，组织学上心肌纤维化区域及凋亡心肌细胞明显减少，同时血清中促炎因子表达下降伴有心肌组织中ERK/NRF1通路显著激活（P<0.05）。但在SFN治疗基础上给予SCH772984可明显阻断SFN对MI大鼠心肌的保护治疗作用，心功能和炎症反应显著恶化，心肌纤维化及细胞凋亡水平增高。结论：SFN可能通过激活ERK/NRF1信号通路改善MI大鼠心室重构而保护心功能。

关键词：
MI
心肌梗死
核呼吸因子1
细胞外调节蛋白激酶
萝卜硫素
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心肌梗死（myocardial infarction,MI）是一种高病死率的心肌缺血性疾病，以冠状动脉病变导致的缺血缺氧为主要特征，近年发病率显著升高，高龄患者往往预后极差[1]。冠状动脉堵塞导致的缺氧会直接诱导心肌细胞发生凋亡，凋亡后的细胞不能再生而是会发生纤维化修复，纤维化心肌组织会进一步降低心脏顺应性并导致心室重构，最终导致心力衰竭使心脏丧失功能[2,3]。目前针对这一不可逆的病变过程尚无有效治疗药物。

萝卜硫素（sulforaphane,SFN）是十字花科植物中最为常见的抗氧化成分，也具有很强的抗癌活性[4,5]。既往报道SFN可通过调控细胞内氧化应激水平延缓炎症导致的肝脏纤维化进展，但SFN对于MI后心肌纤维化的作用仍待进一步验证[6]。细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）/核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1）信号通路是细胞内最为常见的抗氧化信号轴，丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）是其上游激活分子，细胞接受外界信号后MEK与ERK会依次发生磷酸化激活，最终驱动NRF1向细胞核内转运诱导靶基因表达，从而发挥抗氧化作用[7]。本研究构建了MI大鼠模型，基于ERK/NRF1通路探究了SFN对MI大鼠心室重构后心肌纤维化的治疗作用，为未来MI及其并发症的治疗提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠48只，8周龄，每只体质量约350 g，购自上海亓上生物医学科技有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2021-0004。大鼠饲养在SPF级动物房，温度维持在（24.0±2.5）℃，相对湿度维持在50%左右，每日光照12 h。本研究获得陆军军医大学第一附属医院（西南医院）伦理委员会批准（202108356）。

1.1.2 试剂

SFN(S5771）、SCH772984(S7101）购自上蓝木化工；蛋白提取试剂盒（P0033）、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（C0105S）、TUNEL试剂盒（C1091）购自上海碧云天；Masson三色染色试剂盒（BJ-P63894）购自邦景生物；IL-1β(EK301B）、TNF-α(EK382）、IL-6(EK306)ELISA检测试剂盒购自上海联科生物；GAPDH抗体（ab8245）、NRF1抗体（ab175932）、MEK抗体（ab32091）、pMEK抗体（ab4750）、ERK抗体（ab109282）、pERK抗体（ab201015）、山羊抗鼠二抗（ab6728）、山羊抗兔二抗（ab205718）购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组

48只雄性SD大鼠，随机选择12只作为假手术（Sham）组，剩余36只大鼠通过结扎冠状动脉左前降支构建MI模型[8]。大鼠麻醉并固定于小动物操作台上，异氟烷气体麻醉大鼠并连接小动物呼吸机予以正压通气保证气道通畅。无菌操作下去毛切开皮肤，打开胸腔并暴露心脏，用5-0丝线缝扎冠状动脉左前降支，术中心电图显示持续性ST段抬高提示造模成功。后缝合胸腔及皮肤，待大鼠恢复自主呼吸后予以拔管，术后给予抗生素持续注射预防术后感染。Sham组仅打开胸廓并穿针，但并不缝扎血管。36只造模成功的大鼠随机分为MI模型组、SFN治疗组（10 mg/kg，腹腔注射）、SFN+SCH772984(ERK抑制剂）组（10 mg/kg+15 mg/kg，腹腔注射），每组12只。术后给予对应治疗药物和溶剂对照进行治疗，1次/d，连续2周给药。

1.2.2小动物心脏超声检查

手术造模2周后，异氟烷气体麻醉大鼠，麻醉状态下用小动物心脏超声仪检测各组大鼠射血分数（ejection fraction,EF）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter,LVESD）、短轴缩短率（fractionalshortening,FS）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD）。超声下连续测量至少3个心动周期，根据结果取平均值进行比较。

1.2.3 血清炎症因子检测

待完成心脏超声检查之后，各组大鼠进行眼球取血，静置15min后3 000 r/min离心10 min，吸去上层血清进行ELISA检测验证因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平，具体实验操作参考试剂盒说明书。完成取血操作后一部分心肌组织进行液氮速冻低温保存，另一部分置于4%多聚甲醛中固定备用。

1.2.4 H&E染色及Masson三色染色观察心肌病理变化

待完成大鼠取血之后，各组大鼠取心脏组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，后进行脱水、石蜡包埋与切片，常规制备心脏组织石蜡切片。使用HE染色试剂盒及Masson三色染色试剂盒对石蜡切片进行染色，后封片用光镜进行观察拍照。

1.2.5 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

待完成各组心脏组织石蜡切片后，取各组切片进行TUNEL染色，染色过程按照试剂盒说明书进行，然后进行封片采用共聚焦显微镜观察拍照，计数镜下TUNEL+细胞（红色荧光），计算细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=TUNEL+细胞数/总细胞×100%。

1.2.6 Western blot检测心肌组织蛋白表达情况

取1.2.3中冷冻组织加入WB蛋白裂解试剂并置于冰上充分裂解20 min,10 000 r/min离心10 min，取上清液进行蛋白定量。进行SDS-PAGE凝胶电泳时，每个孔道取20µg总蛋白进行上样，经过电泳分离、电转膜和封闭后，加入对应一抗（1∶1 000稀释）过夜孵育，然后加入二抗抗体（1∶10 000稀释）室温孵育1 h，用ECL试剂显色拍照，用Image J软件对条带灰度值进行定量分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析处理。数据间的显著性比较使用单因素方差分析法，组间差异性进一步用Turkey检验进行分析，当P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 SFN挽救MI大鼠心脏功能

SFN化学结构式如图1所示。行冠状动脉左前降支结扎术后，与Sham组相比，MI模型组大鼠心肌结构紊乱、心室搏动减弱、心脏顺应性下降。从心脏功能指标来看，MI组大鼠FE、FS水平明显下降，而LVESD、LVEDD水平升高，提示模型大鼠MI后心功能明显下降（P<0.05）。SFN治疗以后，SFN组大鼠心功能指标水平明显恢复，同时心肌结构、心室搏动及心脏顺应性改善明显，提示SFN可挽救MI大鼠心脏功能（P<0.05）。而SFN治疗的同时给予SCH772984后，大鼠心功能再次恶化，SFN的治疗作用被部分抵消，提示SFN的治疗机制可能依赖于激活ERK通路（P<0.05，图2、表1）。

图1 SFN化学结构式

图2 4组大鼠超声下心肌结构观察

2.2 SFN抑制MI大鼠炎症因子分泌

TNF-α、IL-6及IL-1β是常见的血清炎症因子，在MI后会显著上升，其水平可能与心肌纤维化有关。行冠状动脉左前降支结扎术后，与Sham假手术组相比，MI模型组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平明显升高，提示MI后大鼠全身炎症反应严重（P<0.05）。SFN治疗以后，SFN组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平下降，提示SFN可抑制MI后的炎症反应（P<0.05）。而SFN治疗同时给予SCH772984后，大鼠血清炎症因子再次升高，与心功能变化一致（P<0.05，表2）。

2.3 SFN缓解MI大鼠心肌组织纤维化和病理改变

Sham组心肌组织纤维排列整齐，无炎症细胞浸润，无可见的纤维化组织。行冠状动脉左前降支结扎术后，与Sham组相比，MI组大鼠心肌组织中细胞染色不均且形态不规则，心肌纤维排列紊乱，可见大量炎症细胞浸润和大片纤维化组织，提示MI大鼠心肌纤维化及炎症反应严重。SFN治疗后，SFN组大鼠心肌组织纤维化面积及炎症细胞浸润明显改善，细胞和纤维排列整齐，染色均一而SFN治疗同时给予SCH772984后，大鼠心肌组织中纤维化程度与炎症细胞浸润显著增强，心肌纤维染色稍显混乱（图3）。

2.4 SFN抑制MI大鼠心肌细胞凋亡

行冠状动脉左前降支结扎术后，与Sham组相比，MI模型组大鼠心肌组织TUNEL+细胞比例明显升高，心肌细胞凋亡率上升（P<0.05）。SFN治疗以后，SFN组大鼠心肌组织TUNEL+细胞比例下降，提示SFN可抑制MI诱导的心肌细胞凋亡（P<0.05）。而SFN治疗同时给予SCH772984，大鼠心肌组织TUNEL+凋亡细胞比例再次升高（P<0.05，图4、表3）。

表1 4组大鼠心脏功能指标

表2 4组大鼠血清炎症因子水平

图3 4组大鼠心肌组织HE染色及Masson染色（×20)

图4 4组大鼠心肌组织TUNEL染色（×200)

表3 4组大鼠心肌凋亡细胞比例

图5 4组大鼠心肌组织MEK/ERK/NRF1通路蛋白表达情况

表4 4组大鼠心肌组织MEK/ERK/NRF1通路蛋白表达定量

2.5 SFN激活心肌组织中MEK/ERK/NRF1信号通路

行冠状动脉左前降支结扎术后，与Sham组相比，MI模型组大鼠心肌组织NRF1蛋白表达水平明显受到抑制，同时MEK与ERK磷酸化水平明显下降，提示MI后大鼠心肌组织中MEK/ERK/NRF1信号通路受到抑制（P<0.05）。SFN治疗以后，SFN组大鼠心肌组织中NRF1表达水平明显升高，pMEK/MEK与pERK/ERK比例显著上升，提示SFN激活心肌组织中MEK/ERK/NRF1信号通路（P<0.05）。而SFN治疗同时给予SCH772984，大鼠心肌组织中MEK/ERK/NRF1信号通路激活水平再次受到抑制，提示SFN发挥药理作用依赖于ERK的磷酸化激活（P<0.05，图5、表4）。

3、讨论

心室重构和心功能不全是MI疾病进展后期重要的疾病特征，其中心肌纤维化、心肌细胞凋亡及过度炎症反应是导致心室重构的重要病理生理学过程。解决心室重构和心功能不全是治疗MI、提高患者预期寿命的重要方法，但目前临床尚无特效药物能显著解决这一难题。本研究通过结扎冠状动脉左前降支构建了SD大鼠MI模型，造模成功后的MI大鼠心脏功能显著下降，心肌顺应性和搏动能力丧失，EF、FS水平降低，LVESD、LVEDD水平升高。同时本研究在组织学观察中发现MI组大鼠心肌纤维排列混乱，可见大量炎症细胞浸润和大片纤维化组织，心肌细胞凋亡比例也明显上升，外周血中可见大量促炎因子。以上实验证据均表明造模后的MI组大鼠全身炎症反应严重，心肌组织遭到破坏，大量纤维化修复瘢痕直接抑制了心肌功能。

SFN是一类食物来源的异硫代氰酸盐，最早用于食物类保健品添加剂，后发现单体物质对细胞DNA损伤保护和抗氧化应激反应具有很好的促进作用，因此近年来逐渐用于治疗癌症转移、脓毒血症和器官纤维化等疾病，但具体疗效和治疗分子机制仍然有待进一步验证[9,10]。既往研究中，SFN可通过靶向NRF2转录因子入核驱动一系列抗氧化酶在细胞内表达，参与氧化应激的再平衡[11]。本研究中，给予MI大鼠SFN治疗2周后，大鼠心脏功能明显恢复，LVESD与LVEDD下降接近正常，EF与FS明显恢复上升，同时SFN还可抑制炎症因子分泌和心肌纤维化进展，心肌细胞凋亡率也在治疗后明显下降。这部分实验结果说明SFN对MI引起的心肌损伤和炎症反应具有很好的治疗效果，足量足疗程的SFN可以预防心肌炎症细胞浸润和过度进展的纤维化修复，从而预防心室重构起到保护心脏作用。

NRF1是细胞内碱性亮氨酸家族转录因子，也是细胞内常见的氧化应激反应蛋白，在外界刺激下NRF1可以入核结合于下游基因启动子区域抗氧化反应元件，驱动一系列抗氧化酶的转录表达[12,13]。既往研究发现，槲皮素可通过激活ERK蛋白调控NRF1活性抑制细胞内活性氧蓄积，从而抑制类风湿关节炎过程中的炎症反应[14]。本研究中Western blot实验发现MI造模后心肌组织NRF1、pERK、pMEK的表达显著下调，但给予SFN能显著激活MEK、ERK及NRF1蛋白功能。SCH772984是常用的ERK抑制剂，同时给药SFN与SCH772984能够抵消SFN对炎症反应、心肌纤维化和心功能的保护作用，同时SCH772984也能显著抑制SFN对MEK/ERK/NRF1通路的激活，下调细胞内NRF1表达。以上证据进一步提示SFN极有可能通过激活MEK及下游ERK/NRF1信号通路发挥对MI大鼠心脏功能的保护作用。

综上所述，本研究证明SFN可能通过激活ERK/NRF1信号通路抑制MI大鼠心室重构而保护心脏功能。但本研究仍然具有一定缺陷，ERK/NRF1属于泛靶点的信号通路，SFN直接结合的靶点有待在未来的实验中进一步筛选。

参考文献:

[3]张妍,田立群,冯莹,等.抑制HMGB1对心肌梗死大鼠模型心肌纤维化的影响及机制研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(8):927-930.

[4]王见冬,袁其朋,钱忠明.萝卜硫素研究进展[J].食品与发酵工业,2003,29(2):76-80.

[8]崔健,沈振亚,范红友,等.左冠状动脉前降支结扎法构建大鼠心肌梗死模型[J].中国血液流变学杂志,2011, 21(3):397-399,433,封2.

[10]卢建军,戴晓怡,李响,等.萝卜硫素对子宫内膜异位症模型大鼠在位内膜增殖,血管生成及JAK2/STAT3信号通路的影响[J].中国免疫学杂志,2021,37(11):1297-1301,1307.

[12]周淦,曹杉. Nrf1结构及功能研究进展[J].生理科学进展,2011,42(6):443-445.

基金资助:乐山市科技计划项目(21ZDYJ0126);

文章来源:徐燕梅,罗远林,吴丽虹,等.萝卜硫素激活ERK/NRF1信号通路改善心肌梗死大鼠心室重构的研究[J].中国免疫学杂志,2024,40(04):726-730.