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Nrf2信号通路探讨芪蛭三七汤对心肌梗死大鼠心功能的机制

2024-04-27 160 上传者：管理员

摘要：目的探讨芪蛭三七汤调控核因子红系2相关因子(Nrf)2信号通路对心肌梗死大鼠心功能的影响。方法采用冠状动脉结扎法对24只大鼠建立心肌梗死模型，分为模型组、阳性组和芪蛭三七汤组，每组8只。另取8只大鼠行假伤手术为对照组。芪蛭三七汤组和阳性组分别灌胃芪蛭三七汤和依那普利片溶液，模型组和对照组灌胃等体积生理盐水。利用彩色多普勒超声心动图测定大鼠心功能，用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血清肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量，苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态学变化，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法分析心肌梗死情况，Western法和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法分别检测心肌组织Nrf2、NAD(P)H脱氨酶(NQO)1、血红素加氧酶(HO)-1蛋白及基因相对表达。结果与模型组比较，阳性组和芪蛭三七汤组左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)、Nrf2、NQO1和HO-1蛋白及mRNA明显升高，左室舒张期内径(LVIDd)、左心室收缩期内径(LVIDs)、血清CK、血清CK-MB及鼠脑梗死面积百分比明显降低(均P<0.05)。结论芪蛭三七汤能够改善心功能，其可能作用机制是通过活化Nrf2信号通路抵抗心肌氧化应激机制。

关键词：
冠心病
心功能
心肌梗死
核因子红系2相关因子(Nrf)2信号通路
芪蛭三七汤
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心肌梗死是冠心病的极危重症，发病率一直有升高趋势[1],且致死、致残率极高[2]。冠心病主要以溶栓、经皮冠状动脉介入、搭桥手术等手段治疗，虽然临床疗效好[3,4,5],但仍有具有出血、再灌注等并发症发生。我国在治疗众多疾病，中药具有重要的地位，它不仅有副作用小、患者依从性强等优势，且临床疗效可观。尽管目前芪蛭三七汤改善心血管疾病作用机制尚不清楚，但多项研究证明芪蛭三七汤具有积极治疗作用[6,7,8]。本研究探讨芪蛭三七汤调控核因子红系2相关因子(Nrf)2信号通路对心肌梗死大鼠心功能的影响。

1、材料与方法

1.1 实验材料

动物：32只SPF级SD大鼠，其中雌雄性各16只，平均体质量(215±5)g, 分笼饲养，在室温25 ℃,湿度50%条件下饲养。实验获得医院伦理委员会批准，符合道德伦理要求。主要药物：芪蛭三七汤(准确称取三七、水蛭、桂枝各10 g, 黄芪30 g, 冰片0.1 g, 均匀混合，加100 ml蒸馏水煎煮成汤剂)。依那普利片(广东彼迪药业有限公司，批号：20210903,批准文号：国药准字H44024933)。主要仪器：光学显微镜(型号：CX系列，日本Olympus公司),聚合酶链反应(PCR)仪(型号：Naica, 法国Stilla Technologies公司)。

1.2 模型建立

32只SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组和芪蛭三七汤组(各8只，每组雌、雄各4只。根据文献方法[9],模型组、阳性组及芪蛭三七汤组大鼠皮下注射剂量为60 mg/kg戊巴比妥进行麻醉，后固定于木板上，剪除大鼠胸部皮毛并暴露皮肤，在胸部皮肤消毒后，切开大鼠胸部，暴露心脏后钝性分离左冠状动脉前降支，在其近端结扎以阻断血流。结扎时左心室前壁颜色变为暗灰色，光泽减弱，心肌收缩力减弱或消失判断为心肌梗死模型建立成功。对照组参照以上手术进行假伤对照，但不对冠状动脉前降支进行结扎。所有大鼠在手术后腹腔注射青霉素药物，予抗感染治疗。

1.3 给药方法

建模48 h后，芪蛭三七汤组给予芪蛭三七汤灌胃，阳性组给予2 mg/kg依那普利片溶液灌胃，对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d, 药物干预共14 d。

1.4 心功能评估

最后一次药物干预后，禁食不禁水12 h, 采用彩色多普勒超声心动图评估左室舒张期内径(LVIDd)和左心室收缩期内径(LVIDs)、左心室缩短分数(LVFS)和左心室射血分数(LVEF)。

1.5 血清指标检测

评估大鼠心功能结束后，处死大鼠并迅速采集大鼠腹主动脉血5 ml, 利用离心机离心，取上层清液置于-4 ℃冰箱中备用。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.6 心肌梗死面积

处死大鼠后，立即横向切取心肌组织，进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，镜下观察大鼠心肌梗死情况，采用ImageJ软件分析，计算心肌梗死面积百分比。

1.7 心肌组织形态学观察

剪取大鼠心肌组织，制作石蜡切片，脱蜡后蒸馏水润湿组织，苏木素染色细胞核5 min, 水冲洗5 s, 伊红染色细胞质30 s, 再用水洗后滤纸吸干，用无水乙醇进行脱水，封固后在光学显微镜下观测染色结果。

1.8 Western印迹检测心肌组织核因子红系2相关因子(Nrf)2信号通路相关蛋白表达

剪取心肌组织约1 g于研磨器中，加入液氮粉碎均匀研磨，提取组织总蛋白，使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量法对总蛋白定量测定，按比加入4×蛋白上样缓冲液，95 ℃变性5 min, 置于-20 ℃保存备用。设置浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为 120 V进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印。取聚偏氟乙烯膜用洗涤缓冲液洗膜5 min, 共3次，封闭、室温摇床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液和二抗工作液，进行一抗孵育和二抗孵育后。将新鲜配制的化学发光液滴加到聚偏氟乙烯膜表面，转移至成像分析系统暗箱中曝光，采集图像并分析血红素加氧酶(HO)-1、NAD(P)H脱氢酶(NQO1)和Nrf2蛋白相对表达量。

1.9 实时荧光定量(qRT)-PCR检测心肌Nrf、NQO1、HO-1 mRNA相对表达量

剪取大鼠心肌组织约1 g于研磨器中，加入液氮粉碎均匀研磨，提取组织总RNA,按照PCR逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，PCR引物序列：Nrf2上游：5′-ACCTCGAGTGGGAGGACAAT-3′、下游：5′-TGAGGTTAGAAGCCTCGTGC-3′,长度150 bp; NQO1上游：5′-ATACG GAACCAGCAGAAACAG-3′、下游：5′-TA-TCAAT GGGGCAGTAGCAGA-3′,长度131 bp; HO-1上游：5′-AACAGCAGATGGCCCATACCT-3′、下游：5′-ACGCTGAGGTCCATCTCCTTG-3′,长度130 bp; GAPDH上游：5′-GAGCCTCAAGGTGAAGGTCG-3′、下游：5′-GATGTCGTGATGAGGTTTGAGC-3′,长度138 bp。设置好qRT-PCR体系和条件(95 ℃ 5 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 35 s, 共40个循环)。以2-ΔΔCt公式计算Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验。

2、结果

2.1 各组心功能评估

与对照组比较，阳性组和芪蛭三七汤组、模型组LVEF和LVFS明显降低，LVIDd和LVIDs明显升高(均P<0.05)。与模型组比较，阳性组、芪蛭三七汤组LVEF、LVFS明显升高，LVIDd、LVIDs明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2 各组血清CK和CK-MB表达水平

与对照组比较，阳性组和芪蛭三七汤组、模型组CK、CK-MB水平明显升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性组、芪蛭三七汤组CK、CK-ME水平明显降低(均P<0.05)。见表1。

2.3 各组心肌组织形态及梗死情况

与对照组比较，建模各组心肌纤维排列不一，心肌组织病理损伤程度增加；与模型组比较，阳性组和芪蛭三七汤组心肌组织病理损伤程度减轻。见图1。与对照组比较，阳性组和芪蛭三七汤组、模型组心肌梗死面积百分比明显升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性组、芪蛭三七汤组心肌梗死面积百分比明显降低(均P<0.05)。见表2。

表1 各组心功能、CK和CK-MB表达水平比较

图1 各组心肌组织形态(HE染色，×40)

2.4 各组心肌组织Nrf2、NQO1和HO-1蛋白及mRNA表达水平

对照组、芪蛭三七汤组、阳性组、模型组中Nrf2、NQO1和HO-1蛋白及mRNA依次明显降低(均P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组心肌梗死面积百分比、Nrf2信号通路相关蛋白及RNA表达比较

图2 Western印迹检测各组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达

3、讨论

中药汤剂为液体制剂，内服后吸收快，能迅速发挥药效，另一方面，汤剂可由复方组成，多种药物之间能相互促进、相互制约，增强药物作用效果。以往研究证实，水蛭配伍黄芪对大鼠心肌细胞结构具有改善作用[10];黄芪桂枝五物汤能增强盐酸替罗非班氯化钠注射液对血管内皮功的保护，减轻心肌梗死经皮冠状动脉介入术后患者的心肌损伤[11];三七总皂苷通过应激抑制心肌阻断1型血管紧张素受体/心脏锚蛋白重复蛋白通路，降低了甲胺磷诱导大鼠急性心肌梗死心肌氧化应激水平[12]。芪蛭三七汤由水蛭、黄芪、桂枝、三七和冰片五种中药配方熬制成剂，考虑其治疗心肌梗死具有潜在治疗效果。急性心肌缺血发作时，短时间内大量心肌细胞缺血缺氧，导致凋亡、坏死，加剧心脏负荷状态，随着心室结构的扩张和形状的改变，心脏的收缩力和舒张力减弱[13]。心脏重塑、心脏收缩和舒张与LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs等指标异常改变关系密切，故上述指标常用于评估心功能，准确地反映心脏功能。本研究与Zhang等[14]研究结果一致，提示心肌梗死大鼠心输出功能明显减弱。另一方面，建立心肌梗死模型的大鼠LVIDd和LVIDs异常增厚，符合结扎冠状动脉建立心肌梗死模型而引起心室结构改变[15],侧面验证模型构建的成功性。应用芪蛭三七汤和依那普利片灌胃治疗的心肌梗死大鼠，LVEF和LVFS回升，LVIDd和LVIDs降低，结果表明芪蛭三七汤和依那普利片具有改善心功能的功效。CK和CK-MB是一种与心肌损伤相关的血清学指标，临床上通过观察血清中CK和CK-MB水平增高的程度及动态演变过程，判断是否发生急性心肌梗死，研究表明，血清CK和CK-MB浓度可作为评估心肌损伤标准[16]。本研究结果与其他研究心肌梗死模型结果相一致[17],提示阻断冠状动脉血流后，心肌细胞因缺血缺氧损伤加重，芪蛭三七汤对心肌梗死大鼠心脏功能具有显著药效性。

Xie等[18]认为，增强Nrf2信号通路可以保护心肌梗死后的不良心脏重构；El-Shaer等[19]认为，激活内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/Nrf2/HO-1信号通路可改善心肌梗死模型的炎症和氧化应激。Nrf2信号通路被认为是心肌损伤的主要防御机制的经典通路[20,21],主要以抵抗心肌氧化应激作用，其在心肌梗死发生发展中扮演重要的角色。Nrf2信号通路活化时，可增强心肌细胞HO-1表达，同时HO-1表达上调可以激活抗氧化基因NQO1对抗氧化应激。因此，Nrf2、HO-1和NQO1表达升高在防御氧化应激的内在机制中具有重要的作用。本研究结果表明，芪蛭三七汤具有上调Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达的功能，通过激活Nrf2信号通路来抵抗氧化应激机制。

综上，芪蛭三七汤具有改善心肌梗死大鼠心功能作用，通过激活Nrf2途径来减轻氧化应激，减轻心肌损伤表现，最终改善心脏功能。

参考文献:

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基金资助:海南省卫生计生行业科研项目(19A200179);