中性粒细胞是体内数量最多和反应最快的先天免疫细胞。在病原体侵入的几分钟内，中性粒细胞即被大量募集至感染部位，通过吞噬作用，脱颗粒释放溶菌酶，产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)等来发挥抗病原体作用[1]。Brinkmann等[2]发现了中性粒细胞抗病原体的另一种关键物质，即中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)。NETs是一种由中性粒细胞释放的网状结构，主要由DNA和组蛋白组成。其周围附着各种颗粒蛋白，包括中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、髓过氧化物酶(MPO)、组织蛋白酶G和白细胞蛋白酶3等[3]。这种细胞外网状结构可以捕获病原体，限制病原体的传播，并维持局部高浓度的抗菌物质以杀死病原体。但在急性心肌梗死过程中，NETs的过度释放反而放大了炎症反应，导致组织损伤和不良心血管事件的发生(如心室重塑和心律失常)[4,5]。值得注意的是，PAD4敲除抑制NETs形成的确减少了心肌缺血再灌注损伤和不良心室重塑，但也可能造成心肌梗死后初期的ROS产生增加和炎症损伤加重[6]。因此，需要寻找新的可行性靶点进而精准调控NETs生成。

中性粒细胞膜上表达多种离子通道，包括K+、Ca2+、Cl-通道等，介导多种信号的传递，调节中性粒细胞的迁移及抗炎物质释放[7]。研究表明，这些离子通道在心肌梗死NETs形成过程中也起到了一定的作用。本文将对中性粒细胞膜上离子通道在心肌梗死NETs形成中的作用及其机制进行综述。

1、NETs的形成机制

NETs的形成主要包括两种途径：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)依赖性途径和NOX非依赖性途径。其中PMA通过激活中性粒细胞内PKC和Raf-MEK-ERK等信号通路，诱导NOX相关的ROS释放，促进NETs形成。而钙离子载体A23187及离子霉素介导的NETs形成则独立于NOX,可能需要AKT激酶的活化和线粒体ROS的参与[8,9]。这两种途径最终都导致精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)活化及组蛋白H3瓜氨酸化(CitH3),促进MPO和NE释放，介导NETs形成[10]。此外，通过药理学抑制或siRNA抑制ATG5、ATG7表达水平来抑制自噬，可以显著减少PMA、fMLP及病原体等刺激诱导的NETs形成，但对ROS的释放没有影响。提示除ROS依赖性途径以外，自噬也可能通过ROS非依赖的途径介导NET形成[11]。

2、NETs与急性心肌梗死

2.1 NETs对急性心肌梗死后心脏重塑的影响

研究显示，急性心肌梗死患者血浆中dsDNA(NETs标志物)水平显著升高，与心肌梗死面积呈正相关[12]。GSK484药理学抑制PAD4可以显著减少小鼠心肌梗死后中性粒细胞向梗死区的募集，抑制炎性因子分泌和NETs释放，减轻心肌细胞凋亡，从而减少心肌梗死面积和恢复左心室射血分数，改善心脏结构及功能[13]。同样，DNaseI降解NETs, 可以增加心肌梗死后心肌细胞的存活率，并改善心肌梗死后左心室重塑的程度[14]。并且体外实验发现，NETs可以促进新生大鼠原代心肌细胞的凋亡，进一步证实NETs有致心肌细胞损伤的作用[15]。其中NETs中的组蛋白可介导心肌损伤。组蛋白不仅可以通过与磷脂的静电相互作用对细胞膜造成直接损伤，还可以直接减少巨噬细胞对凋亡中性粒细胞和其他细胞群的摄取，促进炎性递质的释放，加重组织坏死[16,17]。以上这些结果提示，急性心肌梗死过程中NETs水平升高加重心肌梗死的程度，从而影响心脏功能。

另外，NETs水平的升高与心肌梗死后组织纤维化密切相关。研究发现秋水仙碱可以通过抑制NETs的形成，从而减轻心肌梗死后纤维化水平[18]。此外，高度活化的纤维细胞积聚在心肌梗死部位；且体外实验发现，NETs可以诱导单核细胞分化为纤维细胞并激活纤维细胞，促进组织纤维化[19,20,21]。由此可见，急性心肌梗死后NETs水平增加可以介导心肌细胞损伤及纤维细胞活化，加重心肌组织坏死和心肌纤维化。

2.2 NETs对急性心肌梗死后心律失常的影响

Mollenhauer等[22]发现NETs的主要成分——MPO水平与心律失常的发生呈正相关。心肌梗死发生后小鼠室性心动过速发生率增加，伴随血浆MPO水平显著升高；而敲除MPO可以减少心肌梗死后室性心动过速的发生。另外，敲除MPO还可减少刺激诱导的心房颤动发生[23]。MPO可以增加金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)活性，通过促进缝隙连接蛋白(connexin 43,Cx43)降解，影响心肌间的正常电传导。因此，急性心肌梗死后NETs水平增加可能通过介导心肌异常的电重构促进心肌梗死后心律失常的发生。

3、离子通道对急性心肌梗死NETs形成的调控

中性粒细胞上表达多种离子通道，包括小电导钙激活钾通道(small conductance calcium-activated potassium channel, SK)、瞬时感受器电位离子通道(transient receptor potential ion channels, TRP)、P2X受体和囊性纤维化跨膜电导调节体(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)等。在心肌梗死过程中，这些离子通道被不同的刺激活化，参与NETs的形成。

3.1 SK通道

SK通道是钙激活钾通道家族的一员，包括SK 1～3。Krause等[24]采用全细胞膜片钳法，发现离子霉素促进人中性粒细胞外向钾电流增加，首次在人中性粒细胞中发现了非电压依赖性的钙激活钾通道。随后Fay等[25]也采用全细胞膜片钳法，在PLB-985细胞(中性粒细胞样细胞系)上发现，SK通道抑制剂apamin几乎完全抑制Ca2+诱导的外向钾电流，提示中性粒细胞中的钙激活钾通道主要是SK通道；并在mRNA水平上发现SK3在中性粒细胞上表达，进一步证实SK3是中性粒细胞上主要的功能性表达的SK通道。

SK通道在NETs形成中发挥重要作用。Douda等[8]利用SK通道特异性激活剂1-EBIO刺激人中性粒细胞，发现在刺激开始到刺激6 h内NETs水平逐渐升高，提示SK通道活化介导NETs形成。随后该团队探讨了SK通道调控NETs形成的途径，利用NS8593和apamin药理学阻断SK通道或siRNA转染抑制SK3表达后，采用Sytox green核酸染料检测对PMA诱导的NOX依赖性NETs以及A23187介导的NOX非依赖性NETs形成的影响，结果发现，阻断SK3可以显著抑制A23187的作用，但对PMA的作用没有显著影响。Mazzoleni等[26]采用MPO、NE、CitH3三重免疫荧光检测人中性粒细胞NETs形成，同样发现NS8593对PMA诱导的NETs形成没有影响。这些结果提示，活化的SK3可能通过NOX非依赖途径促进NETs形成。此外，Fay等[25]发现1-EBIO促进中性粒细胞胞质ROS形成，基因敲除NOX亚基并不影响1-EBIO诱导的ROS形成；且1-EBIO可以直接促进中性粒细胞线粒体ROS形成，提示SK通道促进NOX非依赖性ROS释放，而对NOX相关ROS没有影响。进一步说明活化的SK3通过NOX非依赖途径促进NETs形成。值得注意的是，Tackenberg等[27]利用MPO-DNA ELISA法检测人中性粒细胞NETs形成水平，发现NS8593可明显减少PMA诱导的NETs形成。这两种研究结果的差异可能源于NETs检测手段的不同，相比于Sytox green动力学检测和免疫荧光检测，MPO-DNA复合物的检测更能反映NETs的变化。因此，SK3通道可能在NOX依赖性NETs形成中也起一部分作用。由此，可以推测中性粒细胞SK通道活化主要通过NOX非依赖性途径促进线粒体ROS产生和NETs形成。

目前关于SK通道介导NETs形成对心肌梗死影响的研究少见报道，但有研究发现，心肌梗死中SK通道激活、抑制SK通道显著降低心肌梗死后室性心律失常的发生，由此推测SK通道可能通过介导NETs形成加重心肌缺血后心律失常的发生[28,29]。

3.2 TRP通道

TRP通道是存在于细胞膜或细胞器膜上的一类非选择性阳离子通道，由6种不同的亚家族组成，包括TRPA(Ankyrin)、TRPC(Canonical)、TRPM(Melastatin)、TRPML(Mucolipin)、TRPP(Polycystin)、TRPV(Vaniloid)家族。其中中性粒细胞上主要表达TRPM、TRPV,参与中性粒细胞活化后的多种功能，包括迁移、颗粒蛋白释放和ROS产生等[30]。

3.2.1 TRPM通道

TRPM通道是对Ca2+、Na+和K+通透的非选择性阳离子通道，包括TRPM 1～8。TRPM2在中性粒细胞中高表达，免疫荧光定位于细胞膜上，能够被ROS、AMP等激活，介导中性粒细胞趋化、迁移和NE释放等多种生物学过程[31,32]。Chauhan等[33]利用全细胞膜片钳，在小鼠腹腔中性粒细胞中发现H2O2诱导的具有TRPM2电流-电压特征的内向钙电流，而TRPM2抑制剂FFA导致H2O2诱导的电流密度显著衰减，提示中性粒细胞上存在TRPM2通道的功能性表达。

TRPM2介导NETs形成。Tripathi等[34]发现FFA药理学抑制TRPM2显著抑制了H2O2诱导的小鼠腹腔和人外周血中性粒细胞胞外Ca2+流入和NETs形成；同时发现敲除TRPM2显著抑制了H2O2诱导中性粒细胞上LC3-Ⅱ/ LC3水平，提示TRPM2介导的NETs形成可能与自噬激活有关。随后，该团队探究了TRPM2介导NETs形成过程中的具体机制，采用蛋白质印迹法，发现敲除TRPM2显著抑制了H2O2诱导的AMPKα1和p38的磷酸化水平；且AMPK和p38特异性抑制剂可以显著抑制H2O2诱导的LC3-Ⅱ/LC3的水平及NETs形成的升高。这些结果提示中性粒细胞上TRPM2可以激活AMPK和p38,通过促进自噬激活，从而介导NETs形成。但TRPM2是否可以诱导ROS增加，参与NOX依赖或非依赖性NETs形成尚不清楚，有待进一步研究。

中性粒细胞上TRPM2介导的NETs形成可能参与心肌缺血再灌注损伤过程。Hiroi等[35]在小鼠心肌缺血再灌注模型中发现，敲除TRPM2可以显著减少心肌组织中性粒细胞浸润和心肌梗死面积，改善心脏收缩能力；而向TRPM2敲除心脏灌注野生型小鼠中性粒细胞显著增加了心肌梗死面积。这些结果提示，中性粒细胞上TRPM2的激活加重了心肌缺血再灌注损伤。而TRPM2通道激活可以促进NETs形成，提示在心肌缺血再灌注过程中，氧化应激等刺激激活中性粒细胞上TRPM2,可能促进大量NETs形成，造成额外的心肌损伤。

3.2.2 TRPV通道

TRPV通道是主要对Ca2+通透的非选择性阳离子通道，几乎表达于所有细胞类型[36]。其中TRPV4在人和小鼠中性粒细胞中均有表达[37]。本课题组使用全细胞膜片钳在小鼠骨髓中性粒细胞膜上发现了TRPV4特异性激动剂GSK101诱导的外向和内向电流，并发现中性粒细胞上TRPV4可诱导Ca2+流入，参与中性粒细胞迁移、趋化及ROS产生等过程，这与其他研究结果一致[38]。由此，推测中性粒细胞存在TRPV4的功能性表达，参与中性粒细胞多种生物学过程。

既往和目前的实验均发现中性粒细胞上TRPV4介导NETs形成[39]。分离小鼠骨髓中性粒细胞并给予GSK101刺激，发现GSK101诱导的NETs水平随浓度的增加(100、300、500 nmol/L)而逐渐升高；GSK101在刺激中性粒细胞后NETs水平逐渐增加，与对照组相比，150 min时NETs水平升高有显著性差异，180 min时基本到达最高水平。随后探究TRPV4介导NETs形成的具体机制，首先利用ROS清除剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂DPI及线粒体ROS抑制剂MitoQ预处理中性粒细胞，结果发现，抑制ROS产生显著减少了GSK101介导的NETs形成。值得注意的是，DPI抑制NETs的效应远大于MitoQ,提示TRPV4主要通过NOX依赖性途径介导NETs形成，也可以通过NOX非依赖性途径介导少量NETs形成。利用信号分子抑制剂处理中性粒细胞，发现抑制P38和PKC可以显著减少GSK101诱导的NETs形成。另外，GSK101诱导早期大量胞质ROS释放和后期线粒体ROS产生，抑制P38可以显著减少GSK101诱导的胞质ROS水平，而抑制PKC可以减少GSK101诱导的胞质ROS和线粒体ROS水平。以上这些结果提示，中性粒细胞上TRPV4活化主要通过激活P38和PKC,促进胞质ROS释放，介导NOX依赖性NETs形成；并且，在中性粒细胞活化后期，TRPV4也可能通过激活PKC促进线粒体ROS产生，介导NOX非依赖性NETs形成。

值得注意的是，心肌缺血再灌注后心脏组织TRPV4表达水平显著升高，激活TRPV4可导致心肌细胞凋亡坏死；而阻断TRPV4可显著减轻心肌梗死面积[40,41]。本课题组进一步发现，向小鼠离体缺血后心脏中灌注野生型小鼠中性粒细胞加重了再灌注后心肌梗死面积，而灌注TRPV4敲除中性粒细胞则没有这种效应，提示中性粒细胞上TRPV4加重心肌缺血再灌注损伤。中性粒细胞上TRPV4活化是否通过诱导NETs形成加重心肌缺血再灌注损伤还需要进一步探究。

3.3 P2X受体

P2X受体是ATP门控的非选择性阳离子通道，对Na+、K+和Ca2+通透，包括7个亚家族(P2X 1～7),其中中性粒细胞上P2X1和P2X7参与NETs形成等多种生物学过程。

3.3.1 P2X1

中性粒细胞上存在P2X1的功能性表达。Lecut等[42]采用全细胞膜片钳技术检测到人中性粒细胞上P2X1激动剂αβMeATP诱导的以快速脱敏为动力学特征的向内电流，并检测到P2X1 mRNA和蛋白水平的表达。αβMeATP增强中性粒细胞迁移能力并促进其向fMLP的趋化；而P2X1抑制剂NF279显著抑制了LPS诱导的中性粒细胞趋化、脱颗粒和吞噬作用，提示P2X1参与调控中性粒细胞多种生物学过程[43,44]。

P2X1参与NETs形成。Alarcón等[45]发现P2X1特异性阻断剂NF449可以显著减少PAF诱导的牛中性粒细胞NETs形成。Quiroga等[46]发现NF449不仅可以抑制PAF诱导的NETs形成，还抑制PAF诱导的线粒体超极化，提示线粒体代谢可能与P2X1介导的NETs释放密切相关。抑制或敲除P2X1促进了中性粒细胞ROS产生，这与NETs形成的趋势不一致，提示P2X1介导的NETs形成可能与NOX依赖或非NOX依赖性途径无关[47]。

P2X1介导的NETs形成参与缺血再灌注损伤。Zhuang等[48]在小鼠肾脏缺血再灌注模型中发现，缺血再灌注后肾脏组织P2X1蛋白表达水平上调，NETs形成增加。而阻断P2X1后NETs形成减少，肾脏缺血再灌注损伤的程度减轻。但P2X1参与NETs发生的具体作用机制还有待研究，并需要在心肌缺血再灌注损伤模型和人中性粒细胞上进一步验证。

3.3.2 P2X7

中性粒细胞上存在P2X7的功能性表达。Suh等[49]发现P2X7激动剂BzATP诱导的人中性粒细胞质膜快速去极化，并在mRNA和蛋白水平检测到人中性粒细胞上P2X7的表达。另外，BzATP促进中性粒细胞ROS产生。

研究发现P2X7在NETs形成中也发挥一定作用。Kim等[50]发现，BzATP增加中性粒细胞上PAD4和CitH3蛋白表达，及dsDNA的释放；P2X7抑制剂A438079可以显著抑制上述反应；在在体实验中进一步发现，向大鼠静脉注射BzATP显著增加了外周血中性粒细胞PAD4和CitH3蛋白表达水平。这些结果提示P2X7活化促进了NETs形成。该团队发现，BzATP可以增加中性粒细胞胞内Ca2+水平和p-PKCα的表达水平，给予Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理可以显著降低BzATP诱导的中性粒细胞胞内Ca2+水平、p-PKCα和CitH3蛋白表达水平，且PKC抑制剂Gö6983也显著抑制了BzATP诱导的NETs形成，提示P2X7介导的NETs形成需要胞内Ca2+和PKC的参与。与BzATP一样，ATP也促进中性粒细胞发生以上反应，并可以被A438079所抑制，提示ATP可以激活P2X7促进NETs形成。另外，ATP增加中性粒细胞胞质ROS和NOX亚基表达水平；ROS清除剂Trolox和NOX抑制剂apocynin均显著减少中性粒细胞PAD4和CitH3蛋白表达及NE-DNA释放水平；而A438079可以显著抑制ATP诱导的胞质ROS释放，提示ATP介导P2X7激活参与NOX依赖性NETs形成。这些结果提示活化的P2X7增加中性粒细胞胞内Ca2+水平，通过促进PKCα活化和胞质ROS产生，促进NOX依赖性NETs的形成。

P2X7介导的NETs可能在缺血再灌注中起到重要作用。Kim等[50]向脑缺血再灌注后大鼠静脉注射BzATP显著增加了脑组织PAD4和CitH3蛋白表达水平，提示P2X7介导脑缺血过程中NETs的形成。Granado等[51]在心肌缺血再灌注大鼠中发现心脏组织P2X7的mRNA和蛋白表达水平上调，使用特异性P2X7受体拮抗剂Brilliant Blue可以显著减轻心肌缺血再灌注过程中心肌细胞的损伤程度，但其是否介导NETs形成加重心肌损伤还需要进一步实验验证。

3.4 CFTR通道

CFTR通道是一种cAMP调节的Cl-通道，RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光结果表明中性粒细胞上存在CFTR的表达，且多位于细胞膜和吞噬溶酶体膜上[52]。目前尚没有电生理结果证实中性粒细胞上CFTR通道的活性，但从囊性纤维化(CF)患者外周血获得的CFTR功能缺陷中性粒细胞或CFTRinh-172抑制的小鼠中性粒细胞中发现异常的脱颗粒反应和杀伤病原体能力受损，提示CFTR通道参与中性粒细胞多种生物学活性过程[53]。

CFTR通道参与NETs的产生。Gray等[54]首次发现与健康对照组相比，在培养6 h后CF患者外周血中性粒细胞的NETs释放明显增多。Han等[55]发现基因敲除CFTR显著诱导小鼠外周血中性粒细胞内Cl-水平增加，血浆NETs标志物MPO、NE和dsDNA水平增多；使用CFTR通道阻滞剂CFTRinh-172孵育小鼠外周血中性粒细胞后发现，中性粒细胞上CitH3蛋白表达水平随CFTRinh-172浓度的增加(0.5、1、2.5和5 μmol/L)而逐渐增加。另外，向小鼠体内注射CFTRinh-172后获得同样的结果，进一步提示CFTR通道在NETs形成中的负调控作用。CFTR调控NETs的具体机制与中性粒细胞内Cl-水平和Cl-激酶SGK1有关。胞外Cl-浓度增加了人外周血中性粒细胞内Cl-浓度，且MPO和NE释放水平随胞外Cl-浓度(0、30、70和100 mmol/L)增加而逐渐升高；中性粒细胞上CitH3蛋白表达水平和dsDNA释放水平也随胞外Cl-孵育时间的增加(0.5、1、2和4 h)而逐渐增加，提示CFTR通道功能缺陷可能导致Cl-流出减少，胞内Cl-水平升高，促进NETs形成。另外研究发现，胞外Cl-促进胞质ROS和线粒体ROS形成；在IB3-1细胞(CFTR基因缺陷细胞系)上也发现更高的胞质ROS和线粒体ROS水平；而给予ROS清除剂NAC显著抑制Cl-诱导的NETs形成[56]。这些结果提示CFTR通道功能缺陷可能导致升高胞内Cl-水平，诱导ROS的大量释放，从而促进NETs形成。但CFTR通道功能缺陷是通过NOX依赖或非依赖途径介导NETs形成还需要NOX和线粒体ROS特异性抑制剂来进一步验证。此外，Han等[57]还在敲除CFTR的中性粒细胞及Cl-诱导的中性粒细胞中发现SGK1磷酸化水平的上调；并且SGK1抑制剂GSK650394显著降低Cl-诱导的胞质ROS和线粒体ROS。提示CFTR功能缺陷诱导胞内Cl-水平升高，激活SGK1,通过促进ROS产生，可能在NOX依赖或非依赖性NETs形成中发挥重要作用。

CFTR通道在心肌梗死过程中调控NETs形成。值得注意的是，动脉粥样硬化性心脏病(包括稳定型心绞痛和急性冠状动脉综合征伴ST抬高)患者中性粒细胞中的CFTR蛋白表达明显降低，伴随血浆dsDNA、MPO和NE水平以及中性粒细胞CitH3蛋白表达水平显著增加。由此可见CFTR通道参与心肌梗死过程中NETs的形成。研究CFTR通道将为NETs形成在心肌梗死中的影响提供新的思路和治疗靶点。

4、存在的问题

目前关于中性粒细胞上离子通道参与NETs形成的研究多来自小鼠骨髓或腹腔中性粒细胞和人外周血中性粒细胞，大部分都缺乏在体动物模型的验证；并且中性粒细胞上P2X1、CFTR等离子通道参与NETs形成的具体途径尚不清楚，其是否通过AKT、PKC等激酶活化调控NETs形成还需要更深入的研究。另外，离子通道介导的NETs形成在心肌梗死过程中的作用还需要在动物模型中进一步研究。

5、总结与展望

在心肌梗死过程中，异常增多的NETs可能会造成心肌结构和功能异常，导致心律失常等不良心血管事件的发生；消除NETs可减少心肌梗死面积、不良心室重塑和心律失常的发生。目前已发现心肌缺血过程中SK、TRP、P2X受体、CFTR等通道的活化参与了NETs形成的调节(图1)。因此，通过靶向离子通道调控NETs生成，减轻心肌梗死后心肌损伤程度，改善心律失常、心室重塑等不良预后，可能为NETs相关心肌损伤的治疗策略提供新的思路。

图1 离子通道参与NETs形成的作用和机制

参考文献:

[5]喻珮,徐承义,宋丹.急性心肌梗死后心脏损伤修复的研究进展[J].临床心血管病杂志,2023,39(7):558-562.

[39]卢凯.TRPV4调节中性粒细胞活化介导心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究[D].华中科技大学,2023.

[40]王斌斌,吴琼峰,廖杰,等.TRPV4通道与缺血再灌注损伤的研究进展[J].临床心血管病杂志,2018,34(7):636-639.

基金资助:国家自然科学基金项目(No:81900324､82170326);

文章来源:吴雨薇,吴琼峰,杜以梅.离子通道调控急性心肌梗死中性粒细胞胞外诱捕网的研究进展[J].临床心血管病杂志,2024,40(05):358-365.