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大鼠脊髓损伤后MicroRNAs表达谱变化

2024-11-18 59 上传者：管理员

摘要：目的：探究大鼠脊髓损伤后microRNAs表达谱变化。方法：将10只成年SD大鼠随机分为假手术组、模型组，建立脊髓损伤模型。术后采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表进行运动功能评分，苏木精-伊红(HE)染色脊髓组织，通过Illumina高通量测序技术，对前期构建的cDNA文库进行RNA-Seq分析。将测序数据与高粱参考基因组对比后，以P<0.05为条件筛选出差异表达基因，通过GO、KEGG等数据库，对DEGs的功能以及参与的调控路径进行分析，并通过RT-qPCR验证RNA-Seq结果的可靠性。结果：假手术组与模型组BBB评分有显著性差异，HE染色观察到脊髓组织结构受损较为严重，脊髓损伤前后microRNAs表达有显著差异。结论：脊髓损伤许多基因表达失调。

关键词：
microRNAs
生理状况
神经保护
脊髓损伤
表达谱
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脊髓损伤与许多病理生理状况有关[1]。尽管对脊髓损伤治疗方法进行了大量研究，但这些干预措施的神经保护作用有限，因此与脊髓损伤相关的神经损伤仍然是一个严重的问题[2]。诱发原发性和继发性损伤的脊髓损伤的病因是多因素的。许多病理过程，包括炎性反应、自噬[3]、血脊髓屏障(BSCB)破坏[4]和小胶质细胞[5]激活在脊髓损伤的发展中起着重要作用。microRNAs(miRNAs)是一类丰富的非编码小RNA,在生理和病理生理过程中作为基因表达的表观遗传调节器发挥作用[6]。其通过与蛋白质编码基因的目标mRNAs进行碱基配对，参与转录后基因沉默，导致mRNA抑制或降解导致蛋白质翻译减少[7]。此外，miRNAs等非编码RNA在神经系统发育和分化过程中以特定发育阶段的方式表达[8],并调节中枢神经系统功能和发育的重要方面[9],包括神经前体细胞的增殖和轴突再生[10]。miRNAs调控星形胶质细胞和少突胶质细胞的发育，包括细胞增殖、成熟和髓鞘形成[11],miRNAs对于发育脊髓白质纤维的星形胶质细胞的分化和形态成熟是必不可少的[12]。miRNAs高度保守，由20～24个核苷酸组成。miRNAs与目标mRNA的3′-非翻译区(UTR)结合，以调节转录后基因[13]。据估计，miRNAs调控人类基因组中一半以上的基因[14]。单个mRNA可能受多个miRNAs调控，单个miRNA可以靶向多个mRNAs,不同的miRNAs可以靶向具有协同效应的相同基因[15-16]。因此，miRNA和下游靶基因之间可以形成多个复杂的调控网络。最新研究表明，脊髓损伤可以诱导miRNA表达的变化[17],并且miRNAs在脊髓损伤中发挥关键的调节作用[18]。因此，全面了解miRNAs在脊髓损伤中的重要作用有助于制定脊髓损伤的预防和治疗策略。本研究旨在探讨脊髓损伤后miRNA表达谱的变化。

1、材料与方法

1.1动物：

SPF级健康SD大鼠10只，6周龄，称重220～240 g,购于成都达硕生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(川)2021-036。大鼠饲养于四川省人民医院，自由进食进水，适应性饲养3 d,室温25℃左右，光照时间为8∶00～20∶00。实验开始于2022年5月10日，截止于2022年10月8日。本研究经四川大学华西医院实验动物委员会批准(批准号：20220713001),严格遵守四川大学华西医院实验动物保护和使用规定。

1.2造模方法：

将大鼠用戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔麻醉，固定于手术台，切开T12水平椎板，暴露脊柱，用5.0 g的冲击装置，在2.5 cm高度处自由落下打击脊髓，大鼠出现身体抖动、鼠尾无规则痉挛抽搐以及脊髓局部红肿为模型建立成功，然后给予伤口消毒缝合，固定处理。采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表进行运动功能评分。

1.3 HE染色：

采集各组大鼠的脊髓组织，4%多聚甲醛固定，经脱水、包埋、切片等步骤制作石蜡切片进行常规HE染色，切片在二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中各脱蜡10 min。顺次将切片移入无水乙醇2 min, 95%、90%、80%乙醇各1 min,蒸馏水洗2 min。苏木素染色5 min,自来水冲洗。使用0.5%伊红染液染色2 min。依次移入80%、90%、95%无水乙醇中各1 min脱水。二甲苯透明2次，各5 min。中性树脂封片。最后在光镜下观察，并用图像采集系统留取图片。

1.4转录组测序：

转录组测序由北京诺和致源科技股份有限公司完成。样品经过RNA提取、纯化、建库之后，基于IlluminaNovaSeq 6000测序平台，对建立的文库进行测序。将转录组测的差异表达基因，进行GO和KEGG富集分析，筛选条件以P≤0.05为阈值，满足此条件为显著富集，随后利用GO功能富集来明确差异表达基因所涉及的生物学功能，以KEGG代谢途径来明确筛选到的差异表达基因所参与主要的生物代谢途径。

1.5 RT-qPCR:

本研究从筛选出的5个差异表达基因，进行实时荧光定量PCR分析，对高通量数据进行检测，试验设置3次生物学重复。利用FastQuant RT Kit(with gDNase)试剂盒(KR106)将样本RNA反转录为cDNA,以actin为内参基因(引物序列见表1)。用MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂盒(MQ10201S)进行RT-qPCR试验。RT-qPCR的总反应体系为20μl,其中包括MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂10μl、cDNA模板1.2μl、上下游引物(10μmol/L)各0.4μl、Nuclease-Free Water 8μl。RT-qPCR反应程序为：预变性95℃、30 s,变性95℃、10 s,延伸60℃、30 s,循环数为40,整个反应程序在FTC-3000P上运行。见表1。

表1差异表达基因的RT-qPCR引物

2、结果

2.1 BBB评分：

假手术组BBB评分[(21.00±0.00)分]与模型组[(1.20±0.84)分]比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HE染色：

假手术组脊髓组织被膜较薄，内含丰富血管，未见明显炎性渗出；灰质和白质分界清晰，其内神经元较多，胞体较大，细胞形态较为正常；灰质四周为白质，染色相对较浅，主要为有髓神经纤维，可见神经纤维上覆有神经胶质细胞。模型组脊髓组织结构受损较为严重，形态结构模糊，灰质和白质大面积坏死伴胶质细胞增生，坏死区域神经元溶解，基本消失不见，神经纤维较为松散、溶解后呈空洞样，坏死区域内可见大量星形胶质细胞及小胶质细胞增生。见图1。

2.3 RNA数据分析：

通过Illimina测序平台，本实验对大鼠脊髓样本的6个miRNA文库进行了高通量测序。本研究使用DESeq2软件，以P值<0.05且|log2FoldChange|≥1为标准筛选差异表达基因。本研究最终得到5个差异表达基因，其中2个基因显著上调表达，3个基因显著下调表达(表2、图2)。对差异基因进行了验证，结果显示rno-miR-450a-3p和rno-miR-450b-3p表达显著高于rno-miR-21-3p、rno-miR-3541和rno-miR-21-5p的表达。

图1小鼠脊髓组织病理图片(HE,×400)

2.4差异基因的GO注释及富集分析：

对差异表达基因进行GO功能注释，共发现了实验组和对照组显著富集的GO条目有655条，在生物学过程中多注释到生物过程的正向调节(GO:0048518)、细胞过程的正向调节(GO:0048522)、多细胞生物体发育(GO:0007275)、生物过程的负调节(GO:0048519)等过程，在细胞组分中多注释到膜结合细胞器(GO:0043227)、细胞内膜结合细胞器(GO:0043231)、细胞器(GO:0043226)、细胞质(GO:0005737)等，在分子功能上主要集中于蛋白质结合(GO:0005515),黏合物(GO:0005488),酶结合(GO:0019899),离子结合(GO:0043167)等。KEGG富集分析用于确定差异表达基因参与的主要生化代谢途径和信号通路。结果表明，差异表达基因显著富集在20个通路中，分别是肿瘤坏死因子信号通路(rno04668)、胃癌(rno05226)、促性腺激素释放激素信号通路(rno04921)、突触小泡周期(rno04721)、内吞作用(rno04144)、调控干细胞多能性的信号通路(rno04550)、谷氨酸能突触(rno04724)、人乳头瘤病毒感染(rno05165)、血小板活化(rno04611)、肝细胞癌(rno05225)、Res信号通路(rno04014)、催产素信号通路(rno04921)、MAPK信号通路(rno04010)、癌症中的蛋白聚糖(rno05205)、mTOR信号通路(rno04150)、癌症中的miRNA(rno05206)、河马信号通路(rno04390)、Wnt信号通路(rno04310)、轴突引导(rno04360)、癌症的通路(rno05200)。

表2差异表达基因分析结果

图2差异表达基因的火山图

3、讨论

脊髓损伤是一个复杂的病理过程，涉及大量的细胞及分子的变化，许多研究表明，miRNAs的表达在神经组织中普遍存在，许多调控神经元分化、神经发生、兴奋、突触发生和可塑性[19]。miRNAs与轴突再生的内在决定因素密切相关。一些MiRNAs已被证明可以调节中枢神经系统损伤后参与轴突生长和轴突再生的靶分子的表达水平。因此，研究脊髓损伤中miRNAs的差异性表达有助于进一步明确脊髓损伤病理过程。

miRNAs是非编码RNA是，不能翻译成蛋白质的RNA,主要起调控作用[20]。非编码RNA通过影响组蛋白修饰或DNA甲基化，或通过改变mRNA功能来调节蛋白质的表达[21]。miRNA功能的灵活性和有效性为建立神经网络提供了空间和时间基因调控能力[22]。如miR-431是神经损伤诱导的miRNA,通过沉默Wnt/β-catenin信号的拮抗剂Kremen1或MiR-133b刺激再生轴突生长[23],miR-133b也已被证明通过靶向RhoA促进初级皮质神经元和PC12细胞的轴突生长[24]。包括miR-124,通过靶向ROCK1 GTPase促进M17细胞的轴突生长[25],miR-222通过靶向PTEN调节DRG神经元的轴突生长[26]。

中枢神经系统损伤后，尤其是脊髓损伤后，许多基因表达失调，这些基因在中枢神经系统继发损伤的发病机制中起着重要作用[27]。这些基因大多受转录后调节因子MiRNA的调节[28],这些基因在损伤后的表达发生了改变[29]。本研究也同样显示脊髓损伤前后MiRNA的表达失调，许多基因在损伤后的表达发生了改变，与其他的研究一致。这些基因在发病机制中起着什么作用则需进一步研究。

基金资助:四川省科技厅科研课题资助[项目编号:21YYJC0321];

文章来源:何燕飞,唐瑷,汪晓宁,等.大鼠脊髓损伤后MicroRNAs表达谱变化[J].吉林医学,2024,45(11):2605-2609.